[发明专利]一种用于促进胰岛素分泌的基因、其制备方法及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于促进胰岛素分泌的基因、其制备方法及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是一种双链RNA(doublestrandedRNA dsRNA)引发的转录后基因静默机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA，dsRNA)导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制(posttranscriptional gene siliencing，PTGS)范畴。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物，真菌，无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，机制也更为复杂。

发明内容：

本发明的目的之一在于提供一种用于促进胰岛素分泌的基因。

本发明的目的之二在于提供该基因的制备方法。

本发明的目的之三在于提供该基因的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于促进胰岛素分泌的基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：

(1).具有SEQ NO 1所示的DNA序列；

(2).与序列表中序列1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。。

一种制备上述的用于促进胰岛素分泌的基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求，设计对应于Kir6.2基因733-753位，即GCA TCT TCA TGA AAA CGG CAC的shRNA的寡核苷酸序列引物，各为53bp，然后进行合成，得到用于促进胰岛素分泌的基因；所述的shRNA的寡核苷酸序列引物为：

Sense：5’-ACA CCG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTG CTT GAA GCC GTT TTC ATG AAG ATG CT-3’

Anti-sense：：5’-AAA AAG CAT CTT CAT GAA AAC GGC TTC AAG CAA GCC GTT TTC ATG AAGATG CG-3’。

一种上述的用于促进胰岛素分泌的基因在制备促进胰岛素的分泌药物中的应用。

本发明设计对与胰岛素分泌有关联的基因的RNAi，并应用胰岛β细胞模型研究其对胰岛素分泌的促进作用。为RNAi在糖尿病的治疗应用提供了一种新方法。

附图说明

图1为shRNA的寡核苷酸序列引物和P^SilenCircle质粒的连接图。

具体实施方式：

一、正常胰岛β细胞的培养：胰岛β细胞HIT-15细胞系培养于37℃，5％CO₂恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，再加入适量培养液以易于混匀细胞；用移液器将其移入15ml离心管中，1500rpm离心3min；去上清；用5ml无菌1×PBS将细胞悬起，并吹打混匀；加约1ml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养，约3天左右传代1次(主要查看细胞有无铺满培养瓶)。

二、大鼠胰岛β细胞的分离：正常大鼠和“糖尿病”大鼠一只，体重200～300g.颈椎脱臼处死后消毒腹部，迅速打开左侧腹腔，沿脾动脉剪取胰腺体尾部分，立即浸入4℃的KRBB溶液中.清洗二次，剪去白色脂肪组织，然后将胰腺剪成小块，转移至盛有5mL消化酶液的三角瓶中，于恒温摇床中37℃保温，摇床转速100r/min，每10min玻璃管反复吹打一次，放置30min将该悬液离心500-1000rpm，离心5min，最后剩下的为夹有少量腺泡团的胰岛.在黑背景的体视显微镜下，胰岛呈圆或椭圆形，灰色或淡棕色，易与腺泡团分辨开.将胰岛用玻管挑出，每只大鼠可以得到直径在100-300μm的胰岛80-100个。

三、Kir6.2-RNAi质粒的设计和转染：根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求，设计对应于Kir6.2基因733-753位(GCA TCT TCA TGA AAA CGG CAC)的shRNA的寡核苷酸序列引物，各为53bp，并进行合成。

Kir6.2-RNAi对应的序列为：