[发明专利]瘤胃菌体蛋白循环的测定方法无效
申请号: | 201010127583.6 | 申请日: | 2010-03-18 |
公开(公告)号: | CN101805779A | 公开(公告)日: | 2010-08-18 |
发明(设计)人: | 王梦芝;高杨;王洪荣;王超;李国祥;曹恒春;徐爱秋;陈旭伟 | 申请(专利权)人: | 扬州大学 |
主分类号: | C12Q1/06 | 分类号: | C12Q1/06;G01N1/30;G01N21/64 |
代理公司: | 南京知识律师事务所 32207 | 代理人: | 卢亚丽 |
地址: | 225009 *** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 瘤胃 菌体 蛋白 循环 测定 方法 | ||
技术领域
本发明涉及一种荧光标记瘤胃细菌技术(FLRB),用于测定反刍动物瘤胃菌体蛋白循环(原虫捕食细菌)的方法。
背景技术
众所周知,由于瘤胃微生态中原虫对细菌的吞噬,导致瘤胃细菌蛋白质的循环(Coleman,1975),使得瘤胃的微生物蛋白质(MCP)量及其氨基酸(AA)组成发生改变,进而改变MCP对宿主动物十二指肠的AA的供应(Leng,1982;Wallace等,1987;Ivan等,2000)。长期以来,由于瘤胃微循环的研究缺少简易可行的研究方法,导致了对瘤胃内菌体蛋白循环的研究,还基本停留在原虫的祛除与否对瘤胃内菌体蛋白量、供给小肠MCP量、宿主的生产性能的影响上(Hsu等,1991a、1991b;Koenig等,2000;韩春艳等,2002;Hristov等,2004;Wang等,2007),对于真正的菌体蛋白循环量却鲜有研究,使之成为该领域多年来不可逾越的“黑箱”,而阻滞了反刍动物消化道蛋白质营养研究与调控技术的发展。因此亟待解决的关键问题是瘤胃菌体蛋白微循环研究方法的建立。为此有人采用同位素标记方法,但此方法涉及特殊设备以及环境问题,不适宜于一般实验室的常规测定使用。
发明内容
为了突破目前反刍动物瘤胃微生物蛋白质循环不能进行研究的现状,本发明提供一种瘤胃菌体蛋白循环的测定方法,该方法采用荧光标记瘤胃细菌技术(FLRB),有效地解决了问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
本发明的测定方法,包括有以下步骤:1)无菌瘤胃液的制备;2)荧光标记细菌(FLRB)的制备;3)吞噬试验;4)氮换算;其中2)步骤中瘤胃液先经过400目滤膜过滤后离心,收集沉淀为细菌,然后用PBS溶液洗涤后悬浸于PBS溶液中;接着加染液对细菌染色后,将染液倒出,再用PBS溶液洗涤,最后密封冷冻保存待用;3)步骤中将FLRB平衡至39℃后加内有活化原虫的培养液进行吞噬试验,该培养液为由从瘤胃瘘管动物中采集的瘤胃液通过步骤1)制备成的无菌瘤胃液和人工唾液盐以体积比1∶2的比例配制而成。
下面对各步骤进行详细阐述:
本发明的1)步骤中的无菌瘤胃液的制备方法为:从瘤胃瘘管动物中采集瘤胃液经充分混合后29,000×g,20min离心,收集上清,4℃保存,一周内使用。
本发明的2)步骤中荧光标记瘤胃细菌(FLRB)的制备方法为:(1)采集瘤胃液过400目滤膜(孔径38μm)滤膜,滤液离心(22,000×g,12min),收集沉淀为细菌,用PBS溶液充分洗涤,然后悬浸于同体积的PBS溶液中;(2)加DTAF(三氯三嗪基氨基荧光素)染液(V/V=1/5样品悬液)染色,60℃水浴2h;(3)离心(22,000×g,12min),将上层DTAF溶液倒出,再用PBS溶液充分洗涤,即密封冷冻保存沉淀(-20℃)待用。
本发明的3)步骤中的吞噬试验的具体操作方式为:(1)采集瘤胃液,过80目滤布;(2)无菌生理盐水充分原虫洗涤,将原虫置于培养液(无菌瘤胃液∶人工唾液盐=1∶2),设置尽量与瘤胃内一样的条件(39℃、厌氧、50r/min摇床)培养30min活化原虫;(3)取FLRB解冻置于水浴锅温度平衡至39℃,加活化原虫培养液进行吞噬实验,以2、5、10、15、20、25、30、35、40min的时间点用微型吸管分别吸取少量液体,转移至载玻片上,迅速加等量的甲醛固定以停止吞噬活动,采样制片立即镜检;(4)设置可见光100-400倍观察原虫形态,荧光(460nm)检测每个原虫体内的FLRB数,每时点皆3重复,每片以12个原虫均值记。
本发明的4)步骤中的氮换算方式为:用FLRB平均体积为0.10μm3,氮的换算系数0.054pg/μm3计算微生物N的吞噬量。
本发明的培养液的制作方式为:1)按照和所圈养的瘤胃瘘管动物所食用的日粮准备试验用培养底物,并根据所圈养的瘤胃瘘管动物的唾液配置试验用人工唾液盐,同时从所圈养的瘤胃瘘管动物中采集瘤胃液制备无菌瘤胃液(以减少培养液中的自由细菌数,使之大大小于所要加入的FLRB浓度);2)将培养底物放入培养瓶中,据体积2∶1的比例将人工唾液盐和无菌瘤胃液加入到培养瓶中,再加入经过滤、洗涤的原虫沉淀,将培养瓶置于39℃水浴摇床、持续通二氧化碳(以营造成厌氧环境)进行培养,摇床转速控制在50r/min。
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