[发明专利]一种改进的标记免疫测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域的一种标记免疫实验方法，具体是指一种 改进的标记免疫测定方法。

背景技术

免疫血清学技术是一类在生物学、医学诊断，研究及其相关制 品生产中应用最为广泛的实验方法之一。标记免疫学创建于上世纪 六十年代中后期，他的出现使多数原有免疫实验方法退出生物学应 用，而部分新的或能与标记技术衔接的原有试验方法则集合为一个 新兴的实验技术领域而得到迅速发展。

标记血清学是标记免疫学中的一个最为重要分支，在近四十年 发展历程中，其敏感性、特异性与稳定性，因实验材料的进步而得 到显著的提高；其发展空间因新的标记物、示踪物及其反应信号探 测方式的不断发掘而得以迅速拓展；操作的便捷程度因实验反应方 式的改进而得到不断改善，这种改善与实验设备自动化的结合显著 降低了实验操作者的工作强度。

既往采用的标记免疫实验就其反应方式而言包括直接法、间接 法、补体法、双抗体(或双抗原)夹心法、几种不同方式的竞争法， 各种不同形式的蛋白芯片技术，以及PAP法等多种。在二十余年的 沿革与发展中，间接法、双抗体夹心法及其部分竞争法的应用迅速 得到普及，他们三者均有两步或以上的免疫反应，而此两步免疫反 应在操作方式上可采用二步法，也可以合并在同一时间平面内进 行，即一步法。由于一步法能在充分保证检测结果特异性、敏感性 与稳定性，在几乎完全相同的实验操作、试剂、与实验仪器条件下， 较二步法节省一次免疫反应时间，并省去一轮洗涤步骤，这一改进 曾作为标记免疫学上的重大技术进步，于上世纪90年代后期在我 国迅速推广。

Hooks效应即钩状现象，表现为当反应体系中待测物质，即抗 原或抗体，浓度升高到一定程度时，检测信号反而下降，甚至出现 假阴性结果。随着标记免疫学技术在方法敏感性上的大幅提高，尤 其是其主要反应方式由传统的二步法简化为一步法，并在我国临床 检验中大幅度普及应用后，由Hooks效应导致的临床检验结果失真 便成为一个十分常见的临床现象。

造成Hooks效应的原因虽可能与待测的免疫分子结构相关，但 反应体系中靶抗原与对应抗体比例的高度失调是其最主要的原因。 这种影响如果发生于某些特殊临床指标如采用一步法ELISA或化学 发光技术进行血清HBsAg筛选，则可造成部分强阳性标本检测信号 的降低或显著降低，甚至导致个别具有高度传染性的强阳性标本在 一步法检测中出现假阴性结果。如果这种漏检发生在献血员筛选， 则势必导致受血者发生输血相关性肝炎的严重临床事件。鉴于该指 标在我国检测规模及其社会影响面极其广大，一步法在献血员HBV 感染者筛选中的应用在我国已被明令禁止。

发明内容

本发明的目的是提供一种能简化二步法的实验操作，同时又能 克服一步法中钩状效应的标记免疫测定方法。

为了实现上述目的，一种改进的标记免疫测定的方法，其步骤 包括：

1)向已包被已知抗体或抗原的固相载体表面加入含待测抗原 或抗体的待测标本，进行免疫反应；

2)向步骤1)的已发生免疫反应的固相载体中加入密度大于上 述待测标本溶液的标记抗体或抗原溶液，静置分层使标记抗体或抗 原覆盖于固相载体表面，使标记抗体或抗原与固相载体表面的对应 免疫物质进行免疫反应；

3)洗去固相载体表面未发生免疫结合的物质；

4)根据常规方法生成检测信号，并据此测定待测标本中靶抗 原或抗体的含量。

所述常规方法采用酶促显色的方法，该方法进行酶促显色反应 后，用酶标记比色计比色，并根据对照或标准曲线孔测值判读实验 结果。

所述常规方法采用化学发光显色的方法，该方法进行化学发光 显色反应后，用化学发光测定仪比色，并根据对照或标准曲线孔测 值判读实验结果。

所述标记抗体或抗原溶液为常规标记溶液中加入惰性有机与 无机分子，使标记溶液的密度大于待测标本溶液。

所述标记抗体或抗原溶液的粘度能使标记溶液与待测标本溶 液分层。

步骤3)所述的洗涤方法为洗涤3-6次，每次洗1-5分钟。

同一体积溶液内溶质数量及种类的不同，会导致他们密度与粘 度的差别。而将两种或以上溶液置于同一容器中时，他们将因密度 上的差别而依次处于容器中不同的位置，密度较高的溶液会沉在相 对下层。合理的溶液粘度对各溶液间界面的维系至关重要。