[发明专利]牛樟芝转基因株及其转基因方法

说明书

【技术领域】

本发明是有关于一种真菌转基因方法，且特别是有关于一种牛樟芝转基因方法。

【背景技术】

牛樟芝生长于海拔450～2000公尺之深山，又名牛樟菇、红樟、樟菇、樟窟内菇，仅生长于台湾特有之牛樟树干的腐朽心材内壁。牛樟芝目前已知具有多种的活性成分，使得牛樟芝具有护肝、提升免疫力、抗氧化与抑制肿瘤细胞生长等作用，为台湾著名且珍贵之药用真菌。牛樟芝内具有的活性成分例如多糖(polysaccharides)、三萜类化合物(triterpenoids)、超氧歧化酵素(superoxide dismutase)、腺甘酸(adenosine)、免疫相关蛋白质(immuno-protein)、数种维生素、麦角固醇(ergosterol)、数种微量元素、核酸、凝集素、氨基酸、固醇类、木质素以及血压稳定物质。

由于牛樟芝只生长于台湾特有牛樟树洞中，且来源越来越少。此外，牛樟芝已被政府列入保育类，再加上目前仍无法以人工方式大量栽培子实体，牛樟芝已不多见。

虽然在实验室中牛樟芝菌丝体容易培养，但人工培养之菌丝体无法形成子实体中某些特定之成分，如三萜类，使得人工培养的牛樟芝的应用价值不似天然牛樟芝。而已知利用功能获得(gain-of-function)之转基因方式，可使生物体产生大量预期之活性成份。因此，此领域之研究者皆期望以转基因方式使牛樟芝菌丝体中具有如子实体中的活性成分。

【发明内容】

纵上所述，本发明一方面是在提供一种牛樟芝转基因方法，以获得活性成份高产的牛樟芝转基因株。

本发明另一方面是在提供一种牛樟芝转基因方法，以农杆菌基因转基因的方式，大量获得转基因系牛樟芝。

依据本发明上述方面，一种牛樟芝转基因方法，于无菌环境中进行。牛樟芝转基因方法包含将具有重组核酸的载体送入农杆菌，以产生转形之农杆菌。培养转形之农杆菌菌体于液态培养基中，形成农杆菌菌液。将农杆菌菌液与牛樟芝菌丝体置于容器内，并研磨容器内之牛樟芝菌丝体与农杆菌菌液，以于容器内形成黏糊状混合物。于麦芽抽出物固态平板培养基上培养黏糊状混合物，以形成牛樟芝转基因株。

依据本发明之上述态样，一种牛樟芝转基因菌丝体，以上述牛樟芝转基因方法转基因产生。

【附图说明】

为让本发明之上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式之说明如下：

图1绘示依照本发明实施方式的一种牛樟芝转基因方法流程图。

【主要元件符号说明】

100：方法            110～180：步骤

【实施方式】

请参照图1，其绘示依照本发明一实施方式的一种牛樟芝转基因方法之步骤流程图。牛樟芝转基因方法100包含以重组核酸转形农杆菌(步骤110)、培养转型农杆菌菌体(步骤120)、提供牛樟芝菌丝体(步骤130)、将农杆菌菌液与牛樟芝菌丝体置于研钵内(步骤140)、研磨农杆菌菌液与牛樟芝菌丝体的混合物(步骤150)、形成黏糊状混合物(步骤160)、培养黏糊状混合物(步骤170)，形成牛樟芝转基因株(步骤180)。上述过程均于无菌环境中完成。

以农杆菌作为转基因工具时，随机转入基因体的外源基因重复套数较少，且转入基因片段在基因组中重组发生率较低，而转基因效率高。因此，将确定功能的重组核酸构建于载体上，再藉由农杆菌将重组核酸送入牛樟芝内表达，藉此获得特定成份高产的转基因系菌丝体。重组核酸例如为具有调控牛樟芝各活性成份表现功能之基因。

根据一实施方式，将2-5ng构建好的重组核酸载体送入农杆菌的感受态细胞中，以产生转形农杆菌(步骤110)，作为后续转基因牛樟芝菌丝体之工具。上述农杆菌品系为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，所使用之载体为pTAG-8。pTAG-8载体具有抗潮霉素(kanamycin resistance)基因与hygromycin phosphotransferase(hpt)基因，用来筛选转形之农杆菌与后续牛樟芝转基因株，可按照台湾专利证书号：119889得到。

将转形后之农杆菌培养于固态培养基上，于28℃培养2～3天。之后挑选单一菌落培养于液态培养基中，以获得大量转形之农杆菌菌液。并将培养后之农杆菌菌液浓度以培养液调整为5×10⁸cfu/ml(步骤120)。