[发明专利]抗肿瘤重组质粒、基因疫苗及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物与现代农业技术领域，涉及一种抗肿瘤基因疫苗，更具体地说，本发明涉及一种含有大鼠细胞色素P450家族26超家族A多肽1(Cyp26a1)的抗肿瘤基因疫苗及其应用。

背景技术

我国现有癌症病人300多万人，每年死于恶性肿瘤的患者约为130万人。每年有160万到200万新发的恶性肿瘤病例，每年死于癌症的患者约为130万，并以3％的速度递增，给我国人民的生活和健康造成巨大威胁，给社会和家庭带来巨大的压力，一定程度上制约了我国经济的可持续发展。乳腺癌是一种严重危害人类，尤其是女性健康的恶性肿瘤。乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤，位列十大高发性肿瘤，大约每100名妇女中就有一人患乳腺癌。虽然男性患乳腺癌的几率比女性少100倍，但是由于检查的忽视，男性乳腺癌患者的致死率较高。在美国，2003年有212,600名妇女经检查患乳腺癌，40,200名妇女死于该疾病。更让人关注和担心的是，到确诊之时，已经有40％的患者发生了转移。乳腺癌有几种不同的组织学类型，其中绝大多数(90％左右)起源于乳腺导管，最常见的乳腺癌是浸润性导管癌；大约5％的乳腺癌发生在乳腺小叶，称为乳腺小叶癌。此外，乳腺癌患者复发的几率也高于一般人群。乳腺癌的治疗包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、生物治疗等，尽管科研工作者对攻克乳腺癌的研究投放了大量的精力，但是一旦发生转移和侵润，乳腺癌的治疗仍然显得非常的棘手。

上世纪九十年代初，一系列关于注射外源基因在体内诱导免疫应答的报道揭开了DNA疫苗研究的序幕，从此基因免疫的新技术引起世界各国的高度重视。由于基因免疫可诱导机体产生全面的免疫应答，同时又具有安全、可靠、生产方便等优点，故1994年世界卫生组织(WHO)拨款把DNA疫苗纳入WHO全球免疫研制开发计划之中。1994年美国国家卫生 研究院(NIH)以国家生物战略发展计划的专项经费资助开展DNA疫苗治疗HIV的研究工作，1995年报导了世界第一例DNA疫苗治疗艾滋病的临床试验，1998-2007年相继报导了DNA疫苗治疗艾滋病的二期临床试验及临床应用报道。实验证明，DNA疫苗由于其编码的抗原可以通过外源和内源两种途径被抗原提呈细胞提呈，所以能激起全面的免疫反应。DNA疫苗技术的核心就是把外源基因组装到含有必要表达调控元件的真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒导入动物体内，使外源基因在体内表达，从而激活机体的免疫系统，引发免疫反应。与传统的疫苗相比，DNA疫苗有很多优势，如疫苗相对稳定，方便生产、运输和保存且便宜；可设计性强；检测、检验方便。实验证明，DNA疫苗由于其编码的抗原可以通过外源和内源两种途径被抗原提呈细胞提呈，所以能激起全面的免疫反应。因此，DNA疫苗技术很快被运用在肝炎、爱滋病、结核病等感染性疾病的防治研究上。近几年DNA疫苗被运用在肿瘤的防治研究上，取得了较大的进展，部分肿瘤DNA疫苗已经进入临床试验阶段。根据肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigens：TAAs)研制的全长基因疫苗可以打破机体免疫耐受，通过MHC-I和MHC-II型抗原提呈途径，引起B细胞反应和CD4+、CD8+T细胞反应。从而有效的保护机体免受肿瘤的侵袭。有研究者通过构建不同种生物间同源DNA疫苗的方法，为肿瘤基因疫苗的研制开辟了一条新的思路。TAAs全长DNA疫苗一个潜在的不利因素就是TAAs体内表达产生的生物学作用。如一些TAAs本身就是癌基因产物，它们在癌变过程中可能起到信号分子的作用(Fong et al.，2001；Pupa et al.，2005)。Zhu等(Zhu et al.，2001)用破伤风毒素无毒性的C片段(Frc)作为佐剂，融合SvFv，构建Id DNA疫苗，结果发现该疫苗不仅对该Id阳性肿瘤有作用，对阴性肿瘤一样有效。上皮癌相关的抗原MUC 1是一种高度糖基化的黏液素，不少分泌腺来源的上皮细胞癌化与细胞过量分泌MUC1相关。免疫实验表明MUC1基因疫苗对于前列腺和乳腺癌的患者有一定的治疗效果，进一步的二期临床正在评价中(Stevenson et al.，2004)。20％到30％的乳腺癌和卵巢癌病人的癌细胞中过量表达生长素受体的赖氨酸激酶HER2(neu，c-erbB-1)，小鼠肿瘤模型实验证明MMTV-HER2基因疫苗可以在体激发CTL反应和抗体，进一步的免疫细胞缺失实验表明仅仅是疫苗诱导的抗体反应本身就能够有效的治疗肿瘤(Renard et al.，2003)。