[发明专利]逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测

权利要求书

1.逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其特征在于：它包括

1)合成含酶切位点编码PTD-SARA的基因序列；

2)PTD-SARA融合蛋白基因的克隆及构建；

3)重组蛋白的诱导表达；

4)重组蛋白的纯化；

5)重组蛋白的体外穿膜活性检测；即重组PTD-SARA穿过HKC细胞胞膜和核膜的能力；加入不同剂量的重组PTD-SARA，SARA和空白对照，检测其在细胞内胞浆和胞核中的表达量；

6)重组蛋白的体外生物学活性检测：即重组PTD-SARA抑制TGF-β1对人肾小管上皮细胞HKC转分化的影响；加入不同剂量的重组PTD-SARA，再用TGF-β1刺激HKC细胞，观察细胞形态和表皮细胞标志物E-cadherin的表达以及间皮细胞标志物α-SMA表达量；

7)重组蛋白的体内生物学活性检测：按建立单侧输尿管结扎梗阻模型，以PTD-SARA为受试药物，SARA、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时肾脏纤维化为检测指标，确定受试药物的逆转纤维化效果；以实验前后大鼠肾脏功能为检测指标，计算血液BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，确定受试药物的逆转肾脏功能的效果。

2.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其特征在于：所述的重组蛋白的体外穿膜活性检测；分别加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml剂量的重组PTD-SARA，SARA和空白对照，免疫印迹检测细胞浆和胞核内PTD-SARA的表达量；浓度为5ng/ml时，相对于内参PTD-SARA组、SARA组以及空白组细胞内SARA的表达分别为0.25，0.17，0.08；浓度为10ng/ml时，相对于内参PTD-SARA组、SARA组以及空白组细胞内SARA的表达分别为0.37，0.23，0.07；浓度为20ng/ml时，相对于内参PTD-SARA组、SARA组以及空白组细胞内SARA的表达分别为0.34，0.25，0.08；PTD-SARA组的穿膜效果显著高于SARA组，10ng/ml是PTD-SARA作用的最佳浓度。

3.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其特征在于：所述的分别加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml剂量的重组PTD-SARA，再用10ng/ml的TGF-β1刺激HKC细胞，此时观察表皮细胞标志物E-cadherin以及间皮细胞标志物α-SMA；空白对照组、SARA组和PTD-SARA组为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml；相对于内参表皮细胞标志物E-cadherin的表达量分别为：0.08，0.26，0.45，0.56，0.54；间皮细胞标志物α-SMA的表达量分别为0.4，0.31，0.13，0.08，0.10。

4.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其特征在于：所述的重组蛋白的体内生物学活性检测，按建立单侧输尿管结扎梗阻模型，以PTD-SARA为受试药物，SARA、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时肾脏纤维化为检测指标，确定受试药物的逆转纤维化效果；以实验前后大鼠肾脏功能为检测指标，计算血液BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，确定受试药物的逆转肾脏功能的效果。