[发明专利]多功能穿梭载体new pBE2 及其构建方法以及利用该载体构建碱性蛋白酶突变库的方法无效
| 申请号： | 201010130089.5 | 申请日： | 2010-03-22 |
| 公开（公告）号： | CN102229942A | 公开（公告）日： | 2011-11-02 |
| 发明（设计）人： | 路福平;黎明;梁晓梅;王春霞;成堃 | 申请（专利权）人： | 天津科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/75 | 分类号： | C12N15/75;C12R1/125;C12R1/07 |
| 代理公司： | 天津盛理知识产权代理有限公司 12209 | 代理人： | 王来佳 |
| 地址： | 300457 天津*** | 国省代码： | 天津;12 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 多功能 穿梭 载体 new pbe2 及其 构建 方法 以及 利用 碱性 蛋白酶 突变 | ||
1.一种多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：其结构包括：LB-P43-KpnI-SP-MCS-RB。
2.根据权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：所述LB、RB为左、右臂，是pBE2经EcoRI/KpnI双酶切酶切获得的大片段的两端。
3.根据权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：所述P43为序列1的强启动子，SP为序列2的嗜碱芽孢杆菌信号肽加前肽部分，KpnI代表酶切位点。
4.根据权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：所述MCS为序列3的多克隆位点上游到下游的顺序分别是：BamHI、Xbal、SalI、PstI、SphI、HindIII酶切位点。
5.根据权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2，其特征在于：所述LB-P43-SP-MCS-RB为环状，总长度为6876bp。
6.根据权利要求1或3所述的多功能穿梭载体new pBE2的构建方法，其特征在于：所述P43强启动子来自于pWB980载体。
7.一种如权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2的构建方法，其特征在于：构建方法的步骤为：
(1)双酶切方法获得P43强启动子和pBE2载体大片段；
(2)利用PCR技术获得SP的扩增产物，并引入BamHI酶切位点；
(3)将P43强启动子、SP的扩增产物按顺序依次连入pBE2载体大片段；
(4)连接产物转化大肠杆菌，培养后挑取阳性转化子；
(5)双酶切验证。
8.根据权利要求7所述的多功能穿梭载体new pBE2的构建方法，其特征在于：所述P43强启动子来自于pWB980载体。
9.一种利用如权利要求1所述的多功能穿梭载体new pBE2构建碱性蛋白酶突变库的方法，其特征在于：构建的步骤如下：
(1)随机突变碱性蛋白酶成熟肽基因：据GeneBank报道的嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶的基因序列设计引物，以嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶基因为模板，利用易错PCR技术进行扩增得到成熟肽片段；
(2)将易错PCR扩增得到的成熟肽片段连入new pBE2；
(3)突变基因的克隆：步骤(2)的连接产物转化大肠杆菌，获得阳性克隆；
(4)高通量筛选：提取大肠杆菌中的阳性克隆，转化到枯草芽孢杆菌WB600中，通过高通量筛选获得符合要求的蛋白突变株；
(5)以步骤(4)中获得的功能有所改进菌株的碱性蛋白酶成熟肽基因作为下一轮易错PCR的模板，重复上述步骤，进行多轮易错PCR和高通量筛选，直到获得理想的突变菌株。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于天津科技大学，未经天津科技大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201010130089.5/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
