[发明专利]免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多价疫苗，特别涉及一种免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗，还涉及该疫苗的制备方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。乙型病毒性肝炎简称乙肝，是由HBV引起，主要通过血液、体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。目前世界上有3亿多人为慢性HBV感染，我国约占半数。此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。目前，慢性HBV感染主要采用抗病毒药物如α-干扰素和拉米夫定等进行治疗，但疗效都不甚理想。α-干扰素治疗慢性乙肝的近期应答率为40％～60％，用药后1年的应答率仅为20％～40％，且治疗时可发生与剂量相关的副作用。拉米夫定治疗慢性乙肝持续用药1年时，乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阴转率为20％～25％，HBeAg血清转换率为15％～20％，治疗时间长易出现耐药及HBV DNA多聚酶基因酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)变异，停药后常导致反跳。因此，积极寻求更为有效的抗病毒药物仍为当务之急。

研究发现，HBV感染的慢性化主要是由于机体对HBV的免疫应答特别是细胞免疫应答不能清除病原，从而导致感染的持续存在。在急性HBV感染时，机体存在大量的针对HBV多个抗原表位的多特异性、多克隆的细胞毒性T细胞(CTL)应答，而在慢性HBV感染时，这些CTL应答非常微弱甚至检测不到。因此，采取恰当的免疫方式，打破机体对HBV的免疫耐受，重建活跃的免疫应答，有望清除病毒，终止慢性HBV感染。

目前，我国还没有乙肝治疗性疫苗正式上市，国内很多单位都在进行乙肝治疗性疫苗的研究，从目前研究结果来看，乙肝治疗性疫苗较现有抗病毒药物疗效更好。在乙肝治疗性疫苗的研制中，基于乙肝病毒蛋白抗原CTL表位的多肽疫苗的研制是一个重要方向。但是，单纯的多肽疫苗存在免疫原性弱、半衰期短及不易被APC摄取等固有缺陷，必须对其进行修饰、改进。

CTL是通过其T细胞受体(TCR)特异性识别抗原递呈细胞(APC)表面的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子-肽复合物而得以活化，并最终杀死靶细胞。其中，与MHC-I类分子特异性结合的短肽即CTL表位在CTL活化过程中起关键作用。但大多数MHC-I类分子只递呈内源性抗原。外源性抗原绝大多数进入MHC-II类抗原递呈途径以激活辅助性T细胞(Th细胞)，仅有少数可被MHC-I类分子递呈，即交叉递呈。因此，如何将外源性短肽有效投入APC内MHC-I类抗原递呈途径是激发特异性CTL应答的关键，也是基于表位开发疫苗的瓶颈问题。

由于细胞膜的屏障作用，生物大分子不能自由进入细胞。近年来，一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽(其长度一般不超过30个氨基酸)相继被发现，其可有效携带外源性大分子进入细胞，并对宿主细胞没有显著毒副作用。这些具有细胞穿透能力的多肽被命名为细胞穿膜肽(CPP)。研究最早的CPP为人类免疫缺陷病毒(HIV)-1的反式激活蛋白Tat。1988年，Green和Frankel证实Tat能跨膜转移到细胞质和细胞核内。1997年，Vives等发现Tat中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片段与蛋白转导功能密切相关，称之为蛋白转导域。进一步研究发现，由Tat第49-57位氨基酸残基组成的序列(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，RKKRRQRRR)即可完全行使蛋白转导的功能，这是Tat既有穿膜特性又无细胞毒性的最小片段。另外，研究发现，Tat49-57可有效促进与之偶联的外源CTL表位进入MHC-I类抗原递呈途径，表现为动力学显著增强，且该过程表现为蛋白酶体/TAP非依赖、氨基肽酶依赖。

内质网(ER)是MHC-I类分子递呈抗原肽的最重要场所，若使外源性抗原肽靶向转运至ER腔，可望增强外源性抗原肽被MHC-I类分子提呈的效率。研究发现，ER滞留信号—赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Lys-Asp-Glu-Leu，KDEL)基序可明显增强与之偶联的外源CTL表位在APC内的MHC-I类抗原递呈效率，并且显著延长APC表面MHC-肽复合物的递呈时间，提示羧基端KDEL基序修饰是将外源肽有效导入APC内MHC-I类抗原递呈途径的一个简单有效的新策略。