[发明专利]一种基于mRNA质核比变化的miRNA靶基因鉴定方法和应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种基于mRNA质核比变化的miRNA靶基因快速、准确鉴定方法；涉及该方法在生物医学领域中的应用。

背景技术：

microRNA简称miRNA，是一种21-25个碱基的非编码小分子RNA，它广泛存在于真核生物中。miRNA基因的初级转录产物(pri-miRNA)在细胞核中被RNaseIII Drosha切割成为前体miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在转运蛋白5(exportin5)的作用下由核内转到胞质中，然后由另一种RNaseIII Dicer进一步切割产生成熟的miRNA。这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成RISC(RNA-induced silencing complex)复合体，从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。大量研究表明，miRNA参与了包括细胞分裂增殖、分化与发育以及代谢等许多重要的生物学过程。但是已经鉴定2的数百条miRNA生物学功能仍然不十分清楚，最主要的原因是这些miRNA的真正靶基因不清楚。预测超过1/3的人类基因都是保守的miRNA靶基因，如何快速、准确定特定miRNA的靶标mRNA是目前有关miRNA研究的瓶颈。加上哺乳动物miRNA与靶标mRNA之间的序列不完全互补性，使得靶标mRNA的确定更加困难。

随着生物信息学的不断发展，一些重要的规则、模式及算法不断应用于miRNA的靶标预测。从2003年第一个靶基因预测软件miRanda到现在，短短的几年时间，已涌现出10余个靶基因预测软件。利用生物信息学的方法预测miRMA的靶标，无疑能够很大程度上避免mRNA靶标寻找的盲目性。但是，生物信息学预测结果往往显示一个特定miRNA的潜在靶标可以是数个、甚至数百个。与此同时，也有不同的研究小组用实验方法来寻找miRNA的靶标，如：将特定miRNA在细胞中过表达或者抑制miRNA之后，利用基因芯片分析mRNA的变化，以此找出相应miRNA的靶基因。最近人们利用AGO蛋白家族既能结合miRNA又能结合mRNA的特性，结合免疫共沉淀的方法来分析与AGO结合的mRNA，作为潜在的miRNA靶标。也有学者通过在培养基种添加同位素标记的氨基酸从蛋白质组学角度来寻求miRNA对应靶标。实验结果都表明这些实验方法的引入发展都是对生物信息学靶标预测的有力补充。但是，很不幸到目前为止没有一种实验方法能够快速、有效、准确的发现miRNA的靶标。

越来越多的实验证据表明，miRNA靶基因不但可以很多，而且在不同的细胞或相同细胞的不同状态之间都可能发生变化，即某一miRNA的功能性靶基因是动态可变的。如何确定某一细胞在特定状态下的功能性靶标对诠释miRNA的功能具有重要意义。

我们通过实验发现，细胞内mRNA质核比变化与miRNA靶标之间有密切相关性。本发明是结合生物信息学预测和细胞内潜在miRNA靶标mRNA质核比变化分析以及Western blot验证，建立了一种快速、准确鉴定miRNA靶基因的方法，该发明可以在miRNA靶基因鉴定方面具有广泛应用。

发明内容：

本发明目的在于建立一种快速、准确miRNA靶基因鉴定方法，该发明可以在医药学中得到广泛应用。

本发明通过以下技术方案实现：首先通过现有的miRNA靶标预测生物信息学软件如Targetscan预测某一miRNA的可能靶基因，然后利用生物芯片或实时定量PCR测定细胞内可能靶基因mRNA质核比变化，寻找mRNA质核比值大于1的可能靶基因，最后经Western blot在蛋白质水平进一步确证即可。

本发明中应用miRNA靶标预测生物信息学软件可以是目前任何常用软件，本发明针对的miRNA是绝大多数目前已知的人类miRNA和其他哺乳动物细胞miRNA。

本发明优点：本发明明建立的miRNA靶基因鉴定技术，具有简单、快速、准确的优点。

附图说明：

图1：利用生物芯片测定获得的miR-200b在HeLa细胞中预测靶基因的质核比值。

图2：Western blot在蛋白质水平确证miR-200b在HeLa细胞中的功能靶基因。

具体实施方式：

下画通过具体的应用本发明技术方法鉴定miR-200b在HeLa细胞中的功能靶基因来进一步描述本发明。

1.生物信息学预测：