[发明专利]一种耐盐碱基因去除标记重组质粒载体

说明书

技术领域

本发明构建了一种安全的植物抗逆表达载体，并实现含有目的基因(SKC1)的该载体在植物中的耐盐性表达。本发明属于植物转基因技术领域。

背景技术

自从1983年世界上诞生第一例转基因植株以来，转基因作物的安全性曾经在全球范围引起很大争议，一个主要的原因足在转基因操作过程中的初期，为了筛选转基因细胞，用于植物表达的载体往往含有抗生素基因和除草剂基因，而当筛选得到目的细胞后，抗生素基因就没有用途了，但它在转基因材料中的存在会特来环境和食品上的安全隐患。因此，近些年来植物转基因研究的热点之一就是实现安全性标记，其中位点特异性重组系统研究得最多也最深入，Cre/Loxp系统是这类之一。

Cre/loxp位点特异性重组系统是Steinberg等首先在大肠杆菌噬菌体p1中发现的，由Cre重组酶和loxp位点两部分组成。Cre重组酶是噬菌体p1编码的分子量为38.5kD蛋白质，由1029个核营酸序列编码，能识别并催化loxp位点的分子内(切除、倒位)和分子间(易位)的特异性重组。

在研究Cre重组酶的结构与功能过程中，Guo等发现该酶由折叠 成较小的N一末端和较大的C一末端两个结构域组成，结构域间通过一个较短的分隔区相连。两个结构域在结合位点周围形成“夹子”结构，以和DNA分子的大小沟部位充分接触。N一末端和序列的识别有关，由第20-120个氨基酸组成，包含5个a-螺旋(A，B，C，D，E)。其中螺旋C，D，E形成反平行束，A，B螺旋垂直于3个反向平行束。螺旋B，D与DNA的大沟相连，螺旋A，E与Cre重组酶四聚体的形成有关。C一末端和DNA的结合及DNA链的切割有关，由第132-341氨基酸组成，包含9个a-螺旋(F，G，H，I，J，K，L，M，N)，螺旋间有2个小的β一折叠片结构。C末端和DNA的接触面复杂，大部分的螺旋和连接环均与DNA分子的大小沟及主链部位相互作用。M和L形成一个疏水区，是Cre重组酶的主要活性中心。螺旋N远离其他螺旋，有助于Cre亚基间相互接触。在重组反应中，与2个loxp位点结合的不同Cre亚基N一端结构相似，而分子间C一末端构象有很明显的差异，这说明不同Cre亚基在重组过程中所起的作用不同。

loxp位点是Cre重组酶介导重组反应时的识别位点，长34bp，包括8bp的间隔序列及两个13bp的反向重复序列。8bp间隔序列是loxp位点中唯一的不对称部位，其中8bp的不对称间隔区是一段重要的核营酸序列，重组过程中DNA链中DNA的切割和连接均在此部位进行。8bp的间隔区从功能上可分为以下3个部分：6，7位是第一次链的交换和连接所必需的；2，5位的4个碱基是第二次链的交换所必需的；1，8位的碱基改变后，如果与野生型loxp位点组合，不会影响重组反应的效率；如果2个loxp位点均为突变型，重组效率将大大降。

Cre重组酶与Loxp位点的反应机制已做了非常深入的研究，其作用机制是一个识别、切割、重组、连接、分离的过程，重组反应是在DNA的两个loxp位点间，过程中没有DNA的合成和丢失，既可以发生在体内、体外的细胞中，也可以在无细胞体系进行。发生反应时每分子的Cre重组酶结合一个loxp位点的反向重复区，即4个Cre重组酶与2个loxp位点结合，形成一个联会复合体结构，其中2个Cre重组酶分子具有重组活性，另外2个没有重组活性。Cre重组酶先和DNA结合，但开始结合力较弱，当遇到loxp位点时结合力大大增强，当有2个loxp时结力更强。然后C末端保守的酪氨酸(Tyr-324)与DNA分子的3’_PO₄结合形成3’一磷酸酪氨酸，导致DNA链的切割；切割后产生的5′-OH既可与同一断裂部位的3’_PO₄结合恢复为原来的构型，也可与另一切割部位的3’_PO₄结合发生链的交换，形成一个“Holliday结构”的中间产物；继而产生结构的异构化，这时第一次切割的2个Cre酶不再起切割作用，而是由另外2个Cre酶进行第二次链的切割和交换，去掉中间产物发生重组，这样便完成了基因的插入或

删除。

loxp位点的8bp非对称间隔区决定了重组反应的模式，位点特异性重组酶系统根居识别位点方向和位置的不同，能够产生3种效应，分别为：

①当一对反向识别位点位于目的基因的两端时，在对应重组酶的作用下，识别位点间的所有基因将发生倒置，即倒位(Inversion)。