[发明专利]一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用。

背景技术

正常细胞的生长不需要精氨酸，因为它们能通过由精氨琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthetase，ASS)和精氨琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase，AL)催化的一个两步反应从 胍氨酸合成精氨酸：然而肝细胞瘤(hepatocellular carcinomas，HCC)、黑色素瘤(melanomas)和其他一些的肉瘤不表达精氨琥珀酸合成酶， 因而它们是精氨酸的营养缺陷型，只能在含有精氨酸的环境中生长；在降解精氨酸的酶类 存在条件下，精氨酸被清除使得这类肿瘤细胞进入“饥饿”状态，进而其生长被抑制。因 此，精氨酸降解酶可以作为肝癌、黑色素瘤等疾病的潜在临床药物。精氨酸脱亚氨酶(arginine deiminase，ADI)能催化精氨酸向胍氨酸的转化，可被用来清除精氨酸。从恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)中提取的精氨酸脱亚胺酶(pADI)，在体外可以有效杀死肿瘤细胞(Jones JB，The effect of arginine deiminase on murine leukemia lymphoblasts(Ph.D.dissertation)， Oklahoma City，OK，University of Oklahoma，1981)，特别是肝癌和黑色素瘤相关的肿瘤细胞， 但是从恶臭假单胞菌中提取的pADI在体内却没能表现出其应有的作用，研究发现是因为 pADI在中性pH下几乎没有酶活性，并且因为恶臭假单胞菌中提取的pADI对实验动物来 说具有很强的免疫原性，进入机体后以后很容易诱导生成抗体，形成抗原-抗体免疫复合物 从实验动物的血液循环中被快速清除。

Takaku等(Haruo Takaku et al.，In vivo anti-tumor activity of arginine deiminase purified from Mycoplasma arginini，Int J Cancer.，51：244-249，1992)从支原体(Mycoplasma arginini) 中分离出另一种精氨酸脱亚胺酶(aADI)。与恶臭假单胞菌来源的pADI不同，aADI在pH 6.0-7.5表现出最高活性，并且在中性pH下非常稳定。但是，与pADI一样，来源于低等微 生物的精氨酸脱亚胺酶由于具有很强的抗原性，易于被人体通过循环系统迅速清除。

蛋白质经化学修饰(如PEG修饰、明胶、多糖修饰等)后，可以有效地屏蔽蛋白质表 面的抗原表位，降低或消除蛋白质本身固有的免疫原性，且修饰后的蛋白质分子量增大， 可延长体内的清除速率，提高其半衰期，因而蛋白质修饰是解决免疫原性的优选方法。聚 乙二醇PEG(Polyethylene glycol)已被确认为一种安全的蛋白质化学修饰试剂，一些用PEG 修饰的药物已在临床上使用。但是，对于用PEG修饰的蛋白，包括精氨酸脱亚胺酶，L-天 冬酰胺酶等都会导致酶活性的下降，甚至完全丧失(Mehvar R，Modulation of the pharmacokinetics and pharmacodynamics of proteins by polyethylene glycol conjugation， J.Pharm Pharmaceut Sci.，3：125-136，2000)。Holtsberg FW等(Holtsberg FW et al.， Poly(ethylene glycol)(PEG)conjugated arginine deiminase：effects of PEG formulations on its pharmacological properties，J Control Release.80：259-271，2002)在研究聚乙二醇修饰精氨酸 脱亚氨酶时发现，当一个精氨酸脱亚氨酶结合8-10个PEG₂₀₀₀₀分子时，其酶活性仅保留了 不到50％，进一步修饰，当结合的PEG分子超过20个时，其活性基本完全丧失，因此， 对于该类蛋白质，需在活性保留和蛋白质PEG修饰率之间进行优选和平衡，才能达到药物 的临床要求。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中存在的问题，提供一种Mycoplasma arginini来源的部分 赖氨酸突变的精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用。