[发明专利]一种大规模生产猪蓝耳病病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及动物病毒培养技术，更具体涉及生产猪蓝耳病病毒的方法。

背景技术

猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征，是一种危害养猪业的病毒性传染病。2006年夏秋季，我国南方部分省份发生猪“高热病”疫情，农业部积极组织科研人员联合攻关，确定猪蓝耳病变异病毒为主要病原，定名为“高致病性猪蓝耳病”。直至今日，疫病形势依然严峻，同其他病毒性疾病一样，目前尚无有效的治疗性药物用于蓝耳病的治疗，免疫接种是防制该病的最有效方法，目前商品化的蓝耳病疫苗主要是由经典株制备的弱毒苗和由变异株制备的灭活苗。而这两种疫苗生产的关键点就是作为抗原的病毒的生产。病毒株生长的培养条件对于获得该株系的所希望的高产量来说具有重大意义。

为了最大化所想要的病毒的产量，系统和培养条件都必须特定地适合于提供对于产生所想要的病毒来说有利的环境。

现有的蓝耳病病毒大规模生产多采用转瓶工艺，但是生产过程中手工操作密集，病毒株受限，细胞维持时间短，密度及活性低等问题，限制了产品的产量、质量的提高和生产成本的降低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种大规模生产蓝耳病病毒的方法。该方法具有生产工艺简单稳定、易操作的特点，病毒产量高，批间差异小，质量易控制等特点，可显著提高疫苗产量和质量。

为达到上述目的，本发明利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统生产猪蓝耳病病毒，包括下列技术步骤：

(1)培养制备病毒用细胞：

将制备病毒用宿主细胞接种到含有培养液与微载体的载体罐，并将上述细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；切换细胞培养程序，在适当培养环境下，提供上述细胞足够的养分和适宜的气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍。

(2)毒液的接种与繁殖：

换用细胞维持培养液，将蓝耳病病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；在适当培养环境下培养病毒；连续培养2～3日后，收获病毒液，

(3)经检验合格后，将收获的病毒液于-20℃冻融两次，灭活纯化得到蓝耳病病毒液。

病毒液检验：按《中华人民共和国兽药典》2005年版附录15、19、20页的相关规定进行检验，完全符合，安全无副作用，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。通过接种细胞，观察致细胞病变作用，根据Reed-Muench法计算病毒含量，每1.0ml病毒含量≥10^8.5TCID₅₀；

上述技术方案中，所述的宿主细胞为可增殖蓝耳病病毒的细胞系，如猴肾细胞系(Marc-145)等。

本发明方法中所述的培养液最好是90％～99％MEM与1％～10％牛血清的混合液，PH值为6.5～8.0较好，加适量抗生素。

上述技术方案中，所述的适宜本发明的微载体可以为具有网状结构的纤维，如聚酯纤维等。

本发明方法中细胞获得气体交换的方式可以通过培养液液面升降的方式实现。

上述技术方案中，步骤(1)中，一般启动贴附程序后4h换成细胞培养程序。所述细胞贴附程序最佳参数为：up：2500mL/min hold 1min、Down：2500mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL；细胞培养程序最佳参数为：up：1900mL/min hold 1min、Down 1900mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL。

上述技术方案中，步骤(1)中所述微载体用量为每500ml培养液添加5.5g微载体较好，细胞的初始接种量为3.0～4.0×10⁷cells/g微载体较好。

上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时细胞密度一般为1.5×10⁸～2.0×10⁸cells/g微载体。

上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时按病毒感染复数(M.O.I.)为0.001～1.5的比例。

上述技术方案中，步骤(2)中，一般启动吸附程序后4h换成病毒培养程序，所述病毒吸附程序最佳参数为：up：1700mL/min hold 1min、Down：1700mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL；病毒培养程序最佳参数为：up：1200mL/min hold 1min、Down 1200mL/min hold 1min、设定最大换液量17500mL。