[发明专利]一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺及其在诱导深绿木酶T2菌株产生几丁质酶中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺及其在诱导深绿木酶T2菌株产生几丁质酶中的应用。

背景技术

甲壳素(Chitin)又名几丁质、甲壳质、壳多糖、聚乙酰氨基葡萄糖等，化学名为1，4-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，是N-乙酰基-D-葡萄糖胺(GlcNAc)以β-1，4键结合而成的直链多聚物(C₁₆H₂₆O₁₀N₂)n。广泛存在于甲壳纲动物虾、蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌(酵母，霉菌)、藻类及植物的细胞壁中。壳聚糖(Chitosan)则是甲壳素脱去C₂乙酰基的产物，又名甲壳胺、脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素、聚葡萄糖胺等，化学名为聚(1，4)-2-氨基-2-脱氧-B-D-葡萄糖。

目前国内甲壳素和壳聚糖的生产主要集中在沿海城市，大多以虾、蟹壳为原料，以蝇蛆为原料获取甲壳素和壳聚糖的甚少。由于来源不同，蝇蛆甲壳素和壳聚糖的获取在工艺条件上与虾、蟹壳同类物质的获取是有差异的，而目前提取蝇蛆甲壳素和壳聚糖所用方法几乎是完全的套用以虾、蟹壳为原料的提取工艺。这种以浓酸浓碱制备甲壳素和壳聚糖的方法，不仅成本高、能耗大、产品品质差，而且会造成严重的环境污染。

木霉菌(Trichoderma spp.)是最有开发利用潜力因而最受关注的一类植物病害生物防治微生物，产生几丁质酶是其主要生防作用机制之一。木霉分泌产生的一系列细胞壁降解酶，如葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等起着重要的作用，其中以几丁质酶尤为重要。目前以对哈茨木霉几丁质酶研究最为深入。据报道木霉几丁质酶在非诱导条件下表达量很少，而在诱导条件下大量产生，其中内切几丁质酶产生较多，并表现出极高的抑菌活性。关于不同营养条件对哈茨木霉、哈茨木霉TM菌株、哈茨木霉P1菌株几丁质酶产生的诱导效果国内外已有报道，而且诱导产生的几丁质酶粗提物对多种病原真菌均有显著的拮抗活性。有关利用蝇蛆甲壳素(几丁质)和蝇蛆壳聚糖(脱乙酰几丁质多糖)对深绿木霉T2菌株产生几丁质酶影响的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提出一种蝇蛆甲壳素、壳聚糖的制备工艺，解决了以浓酸浓碱制备甲壳素和壳聚糖的传统工艺中存在的成本高、能耗大、产品品质差，而且会造成严重的环境污染的缺点。

本发明的另一个目的是提出一种蝇蛆甲壳素在诱导深绿木酶T2菌株产生几丁质酶中的应用。

实现上述目的的技术方案如下：

一种蝇蛆甲壳素的制备工艺，以蝇蛆为原料制成粉体，经除钙、除蛋白质、氧化及还原处理后制得甲壳素，所述除钙过程采用EDTA除钙法。

进一步地，蝇蛆甲壳素的制备工艺，具体包括如下步骤：

(1)原料预处理

将干蝇蛆粉碎，用水冲洗，洗去大量的蛋白质成分，将剩余蛆皮过滤收集备用；

(2)EDTA除钙

称取步骤(1)制得的清洁、干燥的蝇蛆蛆皮，用饱和EDTA溶液浸泡20～30h，除去钙质，后过滤除去EDTA，并将蛆皮用水洗至中性；

(3)稀碱除蛋白质

将步骤(2)处理过的蛆皮再用8～12％NaOH水溶液，沸水浴1.5～3h，以水解蛋白质，加热期间不断搅拌，且期间至少更换4次碱液，加热结束，除去碱液，水洗至中性，得到甲壳素粗品；

(4)精制制得成品

将步骤(3)制得的甲壳素粗品，用0.3～0.8％KMnO₄水溶液浸渍氧化20～60min，水洗除尽KMnO₄后，再用0.5～1.5％草酸水溶液于60～70℃下，搅拌进行脱色反应待产物变白为止，将产物水洗至中性，阴干，得白色片状甲壳素。

采用上述制备工艺制得的蝇蛆甲壳素为原料来制备壳聚糖，其制备工艺包括如下步骤：

(1)脱乙酰反应

将精制的蝇蛆甲壳素与35～45％的NaOH-戊醇溶液混合均匀，置于700～900W微波炉中，以95％功率的微波条件进行脱乙酰反应，处理2次，每次2～3min，中途过滤更换NaOH-戊醇混合液一次；

(2)稀酸溶解

步骤(1)的反应结束后，用热水洗涤产物至中性，再用甲醇浸泡洗涤后，将湿品溶于4～6％醋酸溶液中，过滤除去不溶物；

(3)制得成品

将步骤(2)制得的产物再用8～12％的NaOH溶液中和，析出胶体物，离心洗涤至中性，真空干燥，研细，得到白色壳聚糖粉末。