[发明专利]抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于一种生物制剂的制备方法，具体涉及抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫 苗的制备方法。

背景技术

慢性牙周炎是最为常见的口腔疾患之一，不仅是导致人类失牙的主要因素之一，还是 一些系统疾病的危险因素。有报告称牙周炎患者发生冠心病和中风的几率分别为牙周正常 者的1.4倍和2.1倍；牙周炎会增加呼吸道病原菌在患者咽部的定植，发生慢性肺部感染 及肺功能降低的几率是口腔卫生良好者的2倍；患重症牙周炎的孕妇，发生早产和低体重 儿的危险性是牙周正常孕妇的7.5倍；糖尿病患者中慢性牙周炎发病率明显增高；急性或 亚急性感染性心内膜炎患者中有30％与牙源性感染有关；细菌产生大量的内毒素并进入血 液，可诱发或加重动脉粥样硬化，引发心瓣膜炎甚至缺血性心脏病。究其原因，可能是慢 性牙周炎累及多个牙，感染的面积大，创口开放，细菌及产生的毒素随血液循环系统进入 并定植在其他器官，引起的病变；同时因患牙松动，咀嚼时将牙向根尖部压迫而将微生物 及毒素挤压到血管和淋巴管中，使得牙周组织中的细菌持续性感染刺激宿主的免疫反应。 革兰阴性厌氧菌---牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)以及其他革兰阴性 厌氧菌是慢性牙周炎病变区及活动部位的主要优势致病菌，是公认的慢性牙周炎优势致 病菌之一，与牙周炎的发生、治疗后复发或病情加重密切相关。

目前，牙周炎的治疗主要包括基础治疗、药物治疗和牙周手术等。常规的洁治、刮治 和翻瓣术只能暂时控制菌斑，消除炎症，阻止病变加重，在中度牙周炎治疗中有较好的效 果。但重度牙周炎由于其牙周袋结构的复杂性导致刮治器械进入困难、难以彻底清除龈下 致病菌。龈下刮治术对于医师的临床操作要求较高，医师必须经过系统性的长期培训后才 能有效的清楚菌斑，消除炎症。这对基层医院和基层医师在相当长的一段时期内还是需要 解决的难点。在慢性牙周炎外用治疗药物中，主要是防腐剂和抗菌缓释剂，如氯已定含漱 液和盐酸米诺环素软膏，但是此类药容易产生细菌耐药和毒副作用，不宜长期使用。日本 学者Yokoyama等[1]用纯化后的牙龈素免疫母鸡，结果发现抗牙龈素的卵黄免疫球蛋白 (IgY)可明显抑制牙龈素对人类上皮细胞的降解，阻止细胞基质的破坏；进一步的临床 研究显示卵黄免疫球蛋白(IgY)软膏有助于洁刮治和根面平整后的临床症状改善和减少 牙龈卟啉单胞菌的数量[2]。Hamajima[3]使用抗重组的40kDa的牙龈卟啉单胞菌381外膜 蛋白的卵黄免疫球蛋白能有效抑制Pg菌在口腔细菌上的共聚集。但是，采用特异性卵黄 免疫球蛋白生物制剂治疗慢性牙周炎在国内尚未见到相关研究和有关产品报道。对穿入组 织内的致病菌而言，单纯的基础治疗难以完全杀灭，往往辅助抗生素治疗。然而，抗生素 频繁给药极易造成细菌耐药，且具有毒副作用。

卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk，IgY)是鸡蛋卵黄中的多克隆抗体，具有 耐热、耐酸碱、制备成本低，易于商品化等突出优点。

发明内容

为了寻找一条有效安全的治疗慢性牙周炎的途径，本发明提供一种抗牙龈卟啉单胞菌 卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法。

本发明利用牙龈卟啉单胞菌制成抗原免疫良种鸡，从其所产蛋中制备出抗牙龈卟啉单 胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)，研发高效无毒，易于标准化制备的卵黄免疫球蛋白牙 周袋生物疫苗制剂，依托工业化生产，试图开辟生物抗体防治牙周炎的新途径。

本发明抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法包括以下操作步骤：

(1)牙龈卟啉单胞菌的培养和鉴定

用牙龈卟啉单胞菌国际标准菌株培养分离取得牙龈卟啉单胞菌备用；

(2)获取牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白

将分离出的牙龈卟啉单胞菌在牛脑心浸液(BHI)羊血液体培养基中37℃，80％氮气(N₂)、 10％二氧化碳(CO₂)、10％氢气(H₂)增菌厌氧培养48h，收集细菌，超声震碎至90％细胞完 全破碎，4000r/min×10min离心，收集上清液，即为牙龈卟啉单胞菌全菌可溶性蛋白抗 原，温度4℃保存备用；

(3)蛋鸡免疫