[发明专利]昆虫几丁质酶基因及其dsRNA的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及昆虫几丁质酶基因序列及其dsRNA的应用。

背景技术

农业害虫为害是我国农业产量的主要制约因素，长期施用化学杀虫剂导致一系列问题：1)昆虫出现抗药性，用药剂量加大，防治成本提高；2)农药残留导致环境污染严重；3)对非靶标生物有较大的影响。现有的生物杀虫剂在害虫防治中应用也较广，但杀虫时间较长，效果缓慢。

RNA干扰(RNAi)是一种通常由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默现象，于2006年获得诺贝尔奖。这一发现不仅为基因的功能研究提供了方法上的突破，同时也为人类的疾病治疗和作物害虫防治开辟了新的途径。2007年的“Nature Biotechnology”杂志先后两篇论文报道了施用表达靶向害虫重要致死基因V-ATPase A，CYP6AE14 and GST1的dsRNA转基因植物作为一种控制病虫害的新方法(Baum et al，2007；Mao et al，2007)。2008年，Price and Gatehouse提出了基于RNAi的害虫防治策略。基于RNA干扰技术的害虫防治具有如下优势：1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和和人类是安全的；2)抗虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；3)对环境无毒无害。

发明内容

本发明的目的提供一种昆虫几丁质酶基因及其dsRNA的在致死害虫中的应用。

本发明提供的一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1，是通过对东亚飞蝗EST数据库的搜索，鉴别出7条东亚飞蝗几丁质酶基因片段，检测了这7个几丁质酶基因在东亚飞蝗不同组织部位的表达，筛选出在组织表皮特异表达的与东亚飞蝗蜕皮相关几丁质酶基因LmCHT10，通过RACE-PCR扩增并进一步克隆获得958bp的东亚飞蝗几丁质酶基因。

本发明提供的一种昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：2，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：4和下游引物SEQ ID NO：5，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：2，其含有T7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。

本发明提供的一种合成dsRNA的昆虫几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：3，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：6和下游引物SEQ ID NO：7，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：3，其含有T7启动子。进一步利用试剂盒合成dsRNA。

SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3合成的dsRNA的在致死害虫中的应用：注射上述dsRNA到昆虫体腔，结果表明：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3合成的dsRNA均可以特异性地沉默几丁质酶基因LmCHT10的mRNA表达，并导致蝗虫蜕皮困难而死亡。

附图说明

图1：东亚飞蝗注射SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。A：2龄东亚飞蝗(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA)；B：2龄东亚飞蝗(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA)；C：5龄东亚飞蝗(左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA)。

图2：东亚飞蝗注射SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3合成的dsRNA后几丁质酶基因LmCHT10的mRNA表达，β-actin做为内参基因。A：2龄东亚飞蝗(1为注射dsGFP的对照，2为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA)；B：2龄东亚飞蝗(3为注射dsGFP的对照，4为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA)；C：5龄东亚飞蝗(5为注射dsGFP的对照，6为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA)。

图3：中华稻蝗注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型：左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：3合成的dsRNA的中华稻蝗。

具体实施方式

实施例1：东亚飞蝗几丁质酶基因片段及其dsRNA的获得

1、东亚飞蝗几丁质酶基因片段的获得

1)东亚飞蝗几丁质酶基因在东亚飞蝗表达序列标签EST数据库的搜索

基于东亚飞蝗的表达序列标签(EST)数据库，采用生物信息学方法对东亚飞蝗几丁质酶基因进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得7条几丁质酶基因片段。