[发明专利]一种大肠杆菌和使用该大肠杆菌制备L-半胱氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌，以及利用大肠杆菌进行发酵制备L-半胱氨酸的方法。

背景技术

L-半胱氨酸广泛地应用于医药、食品、化妆品及饲料等行业。目前L-半胱氨酸的生产主要有天然产物提取法、化学合成法、微生物转化法和微生物发酵法。天然产物提取法采用人或动物毛发作为原料，经酸水解或碱水解法提取L-胱氨酸，再经电解还原制得L-半胱氨酸。化学合成法是利用氯代烷类化合物经过氧化反应——加成反应——还原反应——取代反应，最后得到半胱氨酸。微生物转化法是利用DL-2-氨基-Δ²-噻唑林-4-羧酸作为前体经微生物酶转化得到半胱氨酸。这几种方法不仅产率低，能耗大，而且在生产过程中要用到大量的化学试剂，对环境有相当大的危害。

细菌中L-半胱氨酸的合成途径已经被研究清楚了，L-丝氨酸在丝氨酸乙酰转移酶(E.C：2.3.1.30)催化下，与乙酰辅酶A反应生成O-乙酰基丝氨酸，然后在O-乙酰基丝氨酸巯羟基裂解酶(E.C：2.5.1.47)催化下，形成L-半胱氨酸。

野生型大肠杆菌中，L-半胱氨酸对丝氨酸乙酰转移酶(SAT)有很强烈的反馈抑制作用(IC₅₀＝0.8μM)。有文献报道SAT的第95位点的缬氨酸残基被精氨酸替代，第96位点的天冬氨酸被脯氨酸替代后，L-半胱氨酸对其的反馈抑制作用会大幅度减弱(IC₅₀＝1100μM)。(IC₅₀表示SAT活性降低到50％的L-半胱氨酸的含量)。

除了对SAT的反馈抑制作用，细菌体内L-半胱氨酸的含量还受半胱氨酸脱巯基酶的调控。在大肠杆菌中目前已报导的半胱氨酸脱巯基酶有(E.C：4.1.99.1和E.C：4.4.1.8)，它们的编码基因分别是tnaA和metC。但这两个酶的脱巯基作用只在体外实验中得到证明，L-半胱氨酸在细胞内代谢途径中的作用尚不明确。

尽管已经有通过利用L-半胱氨酸对其反馈抑制作用被减弱的SAT的编码基因以及敲除半胱氨酸脱巯基酶的表达基因的方法来制备L-半胱氨酸的技术。甚至还有人通过过量表达一种氨基酸胞外运输蛋白编码基因，提高L-半胱氨酸胞外运输能力来制备L-半胱氨酸。但是目前这些生产L-半胱氨酸的技术的产量及转化率都无法满足工业化的需求，需要有一个更完善的L-半胱氨酸制备技术及一种更高产高效的L-半胱氨酸生产菌种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是要提供一种大肠杆菌和使用该大肠杆菌制备L-半胱氨酸的方法，可使底物的转化率及L-半胱氨酸的产量得到提高。

发明人经过长期和深入的研究，发现抑制谷氨酸半胱氨酸连接酶和磷酸泛酸半胱氨酸连接酶能提高大肠杆菌的L-半胱氨酸的含量，这两个酶的编码基因分别是gshA和dfp。并以大肠杆菌BL21(DE3)为初始菌种，通过基因工程手段对其产L-半胱氨酸能力进行定向改造，得到一种能够生产L-半胱氨酸的菌种以及利用该菌种制备L-半胱氨酸的方法。通过增加丝氨酸乙酰转移酶活性，降低半胱氨酸脱巯基酶活性并提高氨基酸胞外运输能力，使大肠杆菌BL21(DE3)制备L-半胱氨酸的能力得到大幅度提高。

通过对培养基的碳源、氮源、矿物盐及维生素、发酵时间、温度、氢离子浓度指数等指标的研究，确定了利用上文所述菌种制备L-半胱氨酸的最佳发酵条件。

具体地说，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：本发明的大肠杆菌的基因组以大肠杆菌BL21(DE3)为模板，具有如SEQID NO.1所示序列的丝氨酸乙酰转移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。

进一步地，本发明所述大肠杆菌具有通过载体pET22b表达的基因bcr。

本发明使用大肠杆菌制备L-半胱氨酸的方法是：将大肠杆菌先放入种子培养基中培养，后再放入发酵培养基中得到L-半胱氨酸；所述大肠杆菌的基因组以大肠杆菌BL21(DE3)为模板，具有如SEQ ID NO.1所示序列的丝氨酸乙酰转移酶，缺失基因metC、基因tnaA、基因gshA和基因dfp。

进一步地，本发明所述大肠杆菌具有通过载体pET22b表达的基因bcr。

进一步地，本发明所述种子培养基中含有葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物和氯化钠，所述发酵培养基中含有葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、柠檬酸钠和硫代硫酸钠，所述种子培养基和发酵培养基的pH值均为7。