[发明专利]一种基于SDS缓冲液高效土壤残留BT蛋白提取方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及针对不同类型土壤中残留BT蛋白的提取方法，属于生物技术领域。 适用于环境监测、环境保护、农业生产等部门使用。

(二)背景技术

Bt(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性、需氧型芽孢杆菌，在其芽孢形成 过程中，能产生一种以上的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，简称ICPs)。 BT杀虫蛋白可分为α外毒素，β-外毒素、δ-内毒素和虱因子，其中用于转基因植物 的主要是β-外毒素、δ-内毒素。这两种毒素被敏感昆虫幼虫取食后，在其消化道内 消化酶的作用下，蛋白被水解释放出约M_r60×10³～70×10³的活性毒蛋白分子 (toxin)。毒蛋白与昆虫中肠上皮细胞上的特异性受体结合，并发生作用而使细胞膜 穿孔。消化道细胞内的离子浓度和渗透压平衡遭到破坏，使上皮细胞裂解，最终 导致昆虫死亡(崔洪志等，2001)。随着转基因技术的发展，Bt基因陆续被导入 到棉花、玉米、水稻中。转Bt作物的面世与推广种植，给作物害虫防治带来了一 条新的途径(Wu等，2003；Wan等，2004；李浩宾等，2006)。

自上世纪90年代以来，转Bt棉花在我国进行商业化种植已达10余年。据2006 年统计，转Bt棉花种植面积已占我国棉花种植总面积的70％以上(吴孔明，2007)。 随着转Bt作物种植面积的不断扩大，其对生态环境的潜在风险也日益成为国内外 专家和学者研究的热点。转Bt作物在种植以后，在其整个生长期内，会通过根系 分泌物、花粉、植物残茬向土壤释放Bt毒素(Sexena等，1999)，这些分泌的Bt 毒素会和土壤中的粘土矿物和腐殖质等表面活性颗粒吸附，且该结合态毒素仍具 有较强的杀虫活性，在土壤环境中可长时间存留(Sexena等，2004)。土壤是生态 系统中物质循环和能量转化的重要场所，土壤中的动物和微生物种群对于土壤生 态系统的物质降解和能量转换起着非常重要的作用。这些残留的毒索可能会对土 壤中无脊椎动物、微生物种群产生潜在的毒性，影响土壤动物及微生物种群的多 样性结构，从而破坏土壤的物质循环和能量转换(李云河等，2006)。因此，研 究转Bt基因植物毒蛋白在土壤中的残留和降解动态对于保护生态环境安全、保障 人类健康具有十分重要的意义。

目前，对于土壤中残留BT蛋白的检测方法，主要有生物测定法和Dot-ELISA 试剂盒检测法。生物测定法以目标害虫取食转Bt作物组织后的死亡率、化蛹率、 羽化率、体重变化等作为指标，是确认土壤中残留的Bt毒蛋自杀虫活性的一种直 接、有效、简便易行的手段，只需将含有Bt毒蛋白的抽提液直接加入到敏感昆虫 的人工饲料中即可，且灵敏度高，可检测到亚致死剂量的Bt毒蛋白。但生物测试 法需要统一虫源、虫龄和饲养条件，且占用的空间大，检测所需的时间长，环境 因素干扰大，因此难以对大量的样品进行检测(Sims等，1996；Zwahleh等，1994； Tapp等，1997)。ELISA检测法通过提取缓冲液提取土壤中的BT蛋白，然后采 用ELISA检测方法对提取的蛋白进行定性或定量。ELISA检测法操作相对生物测 定法较为简单，检测所需时间短，因此成为目前检测土壤中残留BT蛋白最常用 的一种方法(沈法富等，1999)。由上述两种方法可以看出，在对土壤中BT蛋 白检测的过程中，最为关键的就是能否高效地从土壤中提取BT蛋白。目前提取 土壤中残留BT蛋白的方法主要有碳酸盐法(徐海根等，2008)、人造蠕虫肠道 蛋白提取液法(Shan等，2005)、PBST法。碳酸盐法和人造蠕虫肠道蛋白提取 液法分别是在蛋白的提取缓冲液添加碳酸盐和人造蠕虫肠道蛋白提取液，以提高 缓冲液对土壤蛋白的提取效率。碳酸盐提取法提取效率偏低，对于BT蛋白含量 较低的土壤中，无法提取出BT蛋白，易造成假阴性结果。人造蠕虫肠道蛋白提 取液由于添加液成本较高，无法满足大量样品检测的需要。PBST法是采用美国 Envirologix公司生产的CrylAb/CrylAc检测试剂盒自带的提取缓冲液提取方法， 该试剂盒由于价格昂贵，且提取效率不高，在一定程度上限制了其使用范围。

因此，开发出一种高效、低成本、操作较为简单的土壤BT蛋白提取方法显得 尤为重要。通过该技术，提高土壤中BT蛋白的提取效率，降低检测成本，避免由 于提取蛋白效率过低造成的假阴性结果，从而对土壤中BT蛋白的残留降解动态进 行更加准确地监测。