[发明专利]一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法。

【背景技术】

红霉素(erythromycin，Er)是一类大环内酯类抗生素，包括红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素C(ErC)、红霉素D(ErD)、红霉素E(ErE)和红霉素F(ErF)。在临床上具有广泛用途的是红霉素A，它的抑菌活性最高，最初从一种放线菌--红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)中分离出来。中国药典95版规定红霉素成品的生物效价按无水物计算每1mg效价不得少于920红霉素单位以控制其质量。

红霉素生物合成的一般途径如Fig.1。以丙酰CoA和甲基丙二酰CoA为起始原料，在聚酮合成酶(polyketide synthase，PKS)的催化下，经缩合、酮还原、脱水和烯还原等多轮循环生成红霉素母核6-脱氧-红霉内酯B(6-deoxycrythronolide B，6-dEB)，然后经母核大环C-6羟基化、C-3和C-5O-糖基化、C-3-O-糖基上C-3″-O-甲基化及C-12羟基化，完成红霉素母核的后修饰，形成红霉素A。红霉素A合成途径中有两步羟基化反应，即C-6位和C-12位，分别由羟化酶EryF和EryK催化，这两个酶的空间结构类似于一种细胞色素P450。对于羟基化反应，有文献报道小分子有机溶剂(如二甲基亚砜DMSO、丙酮、乙醇等)可使细胞色素P450酶mRNA量增加，实验证实，添加小分子有机溶剂二甲基亚砜和丙酮能提高细胞色素P450酶的表达量，促进红霉素合成。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种添加二甲基亚砜提高红霉素发酵的方法，具体步骤为：

(1)菌种

红色糖多孢菌HD(Saccharopolyspora erythraea，HD)，本实验室保藏菌种，

参见申请人申请的中国发明专利CN101519637A；

淀粉、黄豆饼粉、糊精由河南天方药业集团提供，其余原料均为工业纯市售产品；

(2)培养基

摇瓶种子及罐一级种子培养基(％)可溶性淀粉2.0，糊精2.5，黄豆饼粉2.5，玉米浆0.8，硫酸铵0.18，氯化钠0.4，碳酸钙0.2，豆油0.2；装量30ml/250ml，消前pH 7.4；

摇瓶发酵培养基(％)：淀粉5.0，黄豆饼粉3.0，玉米浆0.4，硫酸铵0.15，碳酸钙0.4，豆油0.2，葡萄糖2.5，pH 7.0～7.2；

罐二级种子培养基(％)淀粉2.0，黄豆饼粉2.5，糊精2.5，玉米浆2.3，硫酸铵0.15，碳酸钙0.20，豆油0.2，消前pH 7.4；

罐发酵培养基(％)淀粉5.0，黄豆饼粉2.5，糊精2.5，玉米浆2.3，硫酸铵0.15，碳酸钙0.20，豆油0.2，消前pH 7.0～7.2；

(3)摇瓶培养方法

种子培养：将种子液在34℃的摇床间培养48h，摇床转速为220～240r/min；

摇瓶发酵培养：将接入种子液的发酵液在34℃的摇床间培养，摇床转速为220～240r/min，加入二甲基亚砜，浓度为0.08～0.56％，添加时间为0～120h；

所述的二甲基亚砜浓度优选为0.16％；

所述的培养时间优选为48h；

(4)罐发酵培养

将甘油管保藏的菌株按10％接种量接入装有60ml一级种子培养基的500ml一级种子瓶，(34+1)℃培养48h后，按相同接种量接入装量相同的500ml二级种子瓶中，同温培养24h，再按10％接种量接入装有10L发酵培养基的15L发酵罐中，培养7d；

本发明的二甲基亚砜也可以由丙酮，乙醇来代替，或者其他能提高P450酶的试剂等。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

由于二甲基亚砜是具有一定毒性的物质，浓度过高加入，效价显著下降，因此在合适的时间添加适量的二甲基亚砜才会在基本不影响菌体正常代谢的条件下提高的发酵效价。

48h向培养基中流加0.16％的二甲基亚砜，红霉素的效价达7916u/ml，比对照提高11.3％。进一步研究发现，二甲基亚砜可以提高羟基化酶P450单加氧酶的含量，从而提高红霉素产量。

【附图说明】

图1不同时间添加二甲基亚砜对红霉素效价的影响图；