[发明专利]一种硝酸还原酶活性测定新方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种植物体内酶活性测定新方法，尤其是植物体内一种硝酸还原酶活性测定新方法。

背景技术

硝酸还原酶是植物体内硝态氮代谢的第一个关键酶，且硝酸还原酶是一种诱导酶，即在硝态氮(NO₃^-)存在条件下能够诱导产生酶活性。植物从土壤中吸收的硝态氮首先需要经过硝酸还原酶的催化而形成亚硝态氮，亚硝态氮再经过亚硝酸还原酶作用下转化为NH₄⁺，然后NH₄⁺在谷胺酰胺合成酶作用下形成氨基酸，进而完成蛋白质的合成。在植物生长发育过程中，如果硝态氮代谢的第一个关键酶硝酸还原酶活性受到外界环境的影响则植物体内氨基酸和蛋白质的合成就会受到阻碍，从而造成对植物生长发育的严重不利影响。因此，对植物体内硝酸还原酶活性的测定，能正确反应出植物对氮素营养的吸收与代谢能力，是正确评价外界环境对植物氮代谢影响的一种有效方法。目前已有的关于硝酸还原酶活性的测定方法可以归纳为两种：

一、活体法：

这种方法是在反应液中加入硝态氮(NO₃^-)，通过测定硝态氮(NO₃^-)被植物体内硝酸还原酶还原成亚硝态氮的量来反应酶活性的高低。但由于硝酸还原酶是一种诱导酶，其活性会受到反应液中加入硝态氮(NO₃^-)的诱导而提高，因此这种“活体法”测定硝酸还原酶的活性不能真实反应植物体内硝酸还原酶活性，只是作为一种相对比较而加以应用。

二、离体法：

这是一种目前正在应用的测定植物体内硝酸还原酶活性真实值的方法。“离体法”测定植物体内硝酸还原酶活性真实值方法具体步骤是：

1、反应液配制：

(1)利用磷酸二氢钾和磷酸氢二钾配制0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液；

(2)配制0.1mol/L KNO₃磷酸缓冲液；

(3)配制NADH₂溶液：称取2.0mg NADH₂溶于1ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中；

(4)配制提取缓冲液：25mmol/L的磷酸缓冲液、5mmol/L半胱氨酸、5mmol/L EDTA-Na₂混合液。

2、测定方法流程：取实验材料洗净剪碎，放在研钵中置低温冰箱冷冻30min。取出在冰浴中加少量石英砂和提取缓冲液。研磨为匀浆，低温离心5min(4000r/min)。上清液即为粗酶提取液。上述操作尽量在冰浴中进行；

3、比色：取粗酶提取液，加入KNO₃磷酸缓冲液和NADH₂溶液。在30℃下保温30min。保温后立即加1mL对-氨基苯磺酸溶液终止反应，加1mLα-萘胺溶液，显色20min，在台式离心机上离心10min，取上清液在分光光度计上测波长540nm处的光密度值。

离体法具有的缺点是：(1)需要配制的反应液多(共4种)，所需化学药品多，价格贵；(2)测定方法流程复杂、人为造成误差增大。首先需要低温冰冻研钵研磨和低温离心，费工、费时。从研钵中转移至离心管离心时会造成研磨液的损失造成误差；(3)比色时仍需要进一步低温离心，使测定时间加长，造成人为误差加大；(4)方法复杂，难以实现快速、多组测定植物体内硝酸还原酶的真实活性。

本项发明所涉及的这种植物体内硝酸还原酶活性的测定方法是在多年试验基础上获得的一种简便、精确并可快速、多组测定植物体内硝酸还原酶活性真实值的新方法。

发明内容

植物体内硝酸还原酶活性的高低能够真实地反应植物对硝态氮吸收与代谢的能力，是评价环境条件对植物氮代谢影响的一种有效方法。因此，建立一种能够简便、快速测定植物体内硝酸还原酶真实活性的方法在植物氮代谢研究领域具有重要作用。

本项发明解决其技术问题所采用的技术方案是：在保持已有的“离体法”测定硝酸还原酶活性比色时加入的显色剂：对-氨基苯磺酸溶液和α-萘胺溶液不变前提下，进行如下操作：

1、提取液配制：用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和1％(V/V)的1-丙醇配制成100mM，pH7.5的提取液。