[发明专利]分子标记检测N基因控制的烟草TMV抗性的方法

说明书

技术领域：

本发明属地生物技术领域，具体地，涉及一种用于检测烟草品种(系)中是否含有TMV抗性基因(N gene)，从而预测其对TMV的抗性的方法。

背景技术：

烟草普通花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)病是烟草的主要病害之一，一般年份田间发病率约为5～25％，重病年份达50％以上，自苗期至收获期均能发病。TMV侵染感病植株发生系统症状：首先在新叶上发生明脉，几天后形成花叶。严重时病叶畸形，早期发生病株节间缩短，植株矮化，生长缓慢。烟草普通花叶病在中国东北三省、云南、湖南、湖北、福建、四川等烟区普遍发生，严重降低了烟草产量和品质，经济损失惨重。

目前在烟草育种中应用的主要抗源来自黏烟草，黏烟草对TMV的抗性是由显性单基因N控制的。其抗性表现为：当病原物侵染植株叶片后，会在侵染部位出现1～10mm的局部枯斑，即过敏性坏死反应，这些坏死的细胞会阻止侵染植株的病原物进一步扩散。Whithan等(1994年)克隆了N基因。N基因编码TIR-NBS-LRR类抗性蛋白，TIR、NBS和LRR保守域对N基因的功能都很重要。N基因有两个转录产物N_S和N_L，N_S主要在TMV侵染后3小时发挥功能，N_L主要在TMV侵染后4～8小时发挥功能，缺少其中的任何一个转录产物，N基因都不能完全表现对TMV的抗性。该抗源已经成功转入普通烟草品种。我国利用该抗源育成的品种有中国烟草育种研究(南方)中心育成的云烟201、云烟202、云烟203，由中国农业科学院烟草研究所育成的CV87，由辽宁省丹东市农业科学研究所育成的辽烟8号、辽烟12号。从国外引进的抗性资源有Coker176、NC567、NC102、NC297、SC71、SC72、Reams C73等。

另外，普通烟草中的安巴里玛(Ambalema)品种对TMV具有耐病性，且依赖于气温条件。安巴里玛的耐病性是由隐性等位基因rm₁和rm₂控制的，其抗病基因与不良性状基因有连锁关系，所以在育种中很难利用。TI245对TMV的抗性是由隐性基因t1t1t2t2控制的。野生烟草中也有丰富的抗性资源，如残波烟草(N.repanda)、渐尖叶烟草(N.acuminata)、古德斯比氏烟草(N.goodspeedii)等都具有TMV抗性。

烟草是我国重要的经济作物之一，烟草普通花叶病给烟叶生产造成了巨大的损失。种植抗性品种是防治普通花叶病最经济、有效的方法。而培育抗性品种的一个重要环节就是对TMV抗性的鉴定。传统的鉴定方法主要是依靠田间鉴定方法，存在工作量大而且与实验者的接菌成功与否有直接的关系。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷，筛选鉴定烟草N基因特异的分子标记，利用分子标记辅助选择筛选TMV抗性材料。该标记是以N基因核酸序列为模板设计引物，通过PCR扩增，能够在含有N基因的TMV抗性烟草资源中扩增出一条特异条带，而在TMV感病品种或非N基因控制的TMV抗性品种(系)中不能扩增出目的条带。该发明将加速分子标记辅助选择在TMV抗性品种选育中的利用。

为了实验本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

通过特异DNA分子标记检测N基因控制的烟草TMV抗性的方法，以烟草TMV抗性基因N gene部分核苷酸序列为模板设计引物，上游引物N2F：GGCATGACATCTCTGCTTCA，下游引物N2R：CCATTTGAACTGCAAAAGCA；利用该引物对待测烟草样品的DNA进行PCR扩增，扩增产物用电泳检测，若含有1200bp左右的特征条带则待测烟草样品中含有烟草TMV抗性基因N gene。

更具体地方案为：选择待测烟草品种(系)，当烟草长到3～4片真叶时，取叶片，利用CTAB法提取DNA，以DNA为模板，利用引物N2F/N2R进行PCR扩增，PCR体系包括1×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，1.5mmol/L MgCL₂，50ng模板DNA，上下游引物各0.5μmol/L，2U Taq DNA聚合酶；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，56℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸7min；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离检测，若待测烟草品种(系)能够扩增出一条1200bp左右的条带，表明检测品种含有N基因烟草品种，对TMV具有抗性。

本发明更具体的方法可表述为：