[发明专利]一种重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的制备方法及其用途

权利要求书

1.一种重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

1)从培养的多主枝孢霉菌体中提取总RNA，通过RT-PCR合成cDNA；

2)合成引物：

Cla h8-S 5-CCCATATGCCTGGCCAGCAAGCAA-3

Cla h8-as 5-CGGGATCCTTATCTGGTGGTGTAACCA-3

3)以cDNA为模板，通过PCR获得多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8编码基因片段；

4)将编码基因克隆入表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；

5)采用缓冲液对rCla h8包涵体进行洗涤，将其提纯后，采用谷胱甘肽还原系统对其复性，获得重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8；

6)免疫学方法鉴定重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8免疫原性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，Cla h8编码基因如SEQID No：1所示；所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA基因重组，形成适宜表达质粒。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为原核表达载体。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pET19b。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)的宿主菌不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21 Star^TM(DE3)pLysS。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，宿主菌的培养基是LB液体培养基，培养温度是20～37℃，培养时间6～16小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，菌体达到合适的浓度后用IPTG诱导表达，诱导条件为：IPTG浓度为0.1～1mM，诱导温度为20～37℃，诱导时间为2～16小时。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中的纯化方法为：将多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8表达工程菌在37℃诱导3小时后，离心收集菌体，置于冰上超声裂解，然后加入溶菌酶30℃振摇30分钟，离心，收集包涵体蛋白沉淀，以Novagen公司的refolding kit对包涵体蛋白进行提纯与复性后，14000rmp离心20分钟，收集上清，冰箱保存。

11.权利要求1的方法制得的重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8在制备诊断与治疗多主枝孢霉引起的过敏性疾病制剂中的用途。