[发明专利]一种检测蛋白表达水平的试剂盒在制备诊断肝细胞癌的试剂盒中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测玻连蛋白表达水平的试剂盒在制备诊断肝细胞癌的试剂盒中的应用，特别涉及检测玻连蛋白表达水平的试剂盒在制备用于肝细胞癌与肝硬化患者的判别诊断的酶联免疫吸附试剂盒中的应用。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内的恶性肿瘤之一，有较高的发病率和死亡率，每年约650,000人死于HCC，且其发病率有增高的趋势。该病多发于东南亚和非洲，其中约有50％以上发生于中国，位居我国癌症死亡率的第二位。

肝细胞癌的发生情况是一个多因素，多阶段，复杂的过程，乙型肝炎病毒(hepatitisB virus，HBV)慢性感染是重要的高危因素。肿瘤抑制、肝脏切除和移植是现阶段肝癌的主要治疗方法，但约60％到100％的患者会术后复发。因此，在高危人群特别是肝硬化(liver cirrhosis，LC)患者中筛查早期肝癌患者，及时采取治疗措施，可提高肝癌患者的生存率和生活质量。

但HCC早期诊断较难，病情进展快，预后水平低。目前肝炎、肝硬化等HCC高危人群的筛查和HCC临床诊断与病情监测等仍主要依赖于B超等影像学检查联合血清标志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平的检测。而AFP作为目前HCC诊断和病情监测一个最主要的生物标志物，其灵敏度和特异度仍不理想，特别是在临床中有超过30％的HCC病人AFP为阴性，对于这部分患者AFP将无法发挥作用。虽然Des-gamma carboxy-prothrombin(DCP)和lectin-bound AFP(AFP-L3)被认为是很有潜力的HCC诊断标志物，但最近结果表明，AFP对于HCC早期诊断的效果还是要优于DCP和AFP-L3(Marrero，J.A.et al.alpha-Fetoprotein，Des-gamma Carboxyprothrombin，and Lectin-Bound alpha-Fetoprotein in Early Hepatocellular Carcinoma.Gastroenterology(2009))。

寻找敏感的肝癌生物标记物，对于早期发现和诊断肝细胞癌非常重要。近年来，有许多实验室在进行肝癌标记物相关的蛋白质组学研究。对肝癌肿瘤组织进行iTRAQ分析，得到了三种经免疫组化验证的差异蛋白fibroleukin，myeloid associateddifferentiation marker和ornithine carbamoyl transferase(Chaerkady，R.et al. A quantitativeproteomic approach for identification of potential biomarkers in hepatocellular carcin

综上所述，近年来蛋白质组学在肝癌标志物方面的研究，大部分还是停留在发现阶段，在标志物的验证上，特别是血清水平的验证上取得的进展并不多。因此，针对肝脏细胞癌发生过程中具有标志性变化的血清蛋白质建立一种检测方法，有助于肿瘤的临床诊断。

Vitronectin(玻连蛋白)是存在于血液和一些组织中的多功能粘附糖蛋白和扩散因子，可被整合素家族的特定成员识别，在细胞-基质粘附中发挥作用，人体内vitronectin水平的变化与凝血、免疫相关疾病等多种生理和病理过程密切相关，但尚无对其进行血清ELISA检测用于肝细胞癌诊断的报道。(Vitronectin：UniProtKB/Swiss-Prot库蛋白号P04004，GenBank号：X05006)

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)上发展起来的一种新型免疫测定技术，ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体，再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。ELISA最常用的四种方法：直接法测定抗原；间接法测定抗体；双抗体夹心法测定抗原；竞争法测定抗原。

(1)直接法测定抗原的步骤

A.将抗原吸附在载体表面；

B.加酶标抗体，形成抗原-抗体复合物；

C.加底物。

该方法中，底物的降解量＝抗原量。

(2)间接法测定抗体