[发明专利]一种包含Ipr1巨噬细胞异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞

说明书

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种包含Ipr1巨噬细胞特异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞。

背景技术

结核分支杆菌是人畜共患的结核病的致病菌，结核分枝杆菌分为人型、牛型和禽型三种类型，三者存在交叉感染现象。牛型结核分枝杆菌主要侵害牛，牛结核病是由牛分枝杆菌所引起的一种人畜共患的的慢性传染病，其病变特征为病牛逐渐消瘦，在组织器官中形成结节性肉芽肿和干酪样坏死。牛结核病因其易传染，危害严重，因此世界动物卫生组织将其列为B类传染病，我国将其列为二类动物传染。美国首次出现牛结核病是在1917年，而英国、法国等国家将牛结核病处于控制状态，而我国对牛结核病的研究相对比较滞后，我国2003年在广东发生了奶牛结核病，一度还引起市民恐慌，引起了社会的广泛关注。

对于结核病的诊断有细菌学诊断和血清学诊断(包括一些分子生物学的方法)。对于结核病的预防，人的结核病在预防时可以使用卡介苗和结核DNA疫苗等；但是对于牛结核病的疫苗还没有商品化使用，因此不能通过免疫来预防。所以，牛结核病的发病率高，只能加强对牛的检疫，一旦发现结核病阳性牛一律采取扑杀的原则。目前对牛结核病的治疗只能采用抗生素治疗，如链霉素、卡那霉素等。但是，长期使用抗生素不但会使细菌产生抗药性，还存在牛奶中药物残留的问题，所以寻求一种新的治疗结核病的方法迫在眉睫。

随着分子生物学和分子遗传学及基因工程技术的发展与完善，为动物抗病育种提供了新的思路，20世纪80年代采用原核注射生产转基因动物，但该方法存在外源基因的随机整合和配子系传送外源基因的不确定性，限制了该技术的进一步发展。胚胎干细胞体细胞可以代替原核注射，但是在家畜上胚胎干细胞还没有建系，因此也不能得到广泛的应用。随着Dolly羊的诞生，体细胞转基因结合克隆技术培育优良动物品种一度成为基因工程的焦点。

体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(GOO J，et al.An approach for producing transgenic cloned cows by nuclear transfer of cellstransfected with human alpha 1-antitrypsin gene[J].Theriogenology，2006，65(9)：1800-1812.)，该技术的优点是基因转移在体细胞培养阶段进行，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本(WHEELER MB，WALTERS EM.Transgenictechnology and applications in swine[J].Theriogenology，2001，56：1345-69.)。2006年，美国科学家Maga等培育出在乳腺中特异表达人溶菌酶的转基因山羊(Maga E A etal Consumption of milk from transgenic goat expressionhuman lysozyme in the mammary gland result in modulation of intestinalmicrofluro[J].Transgenic Ras，2006，15：515-519)。2009年，西北农林科技大学生物工程研究所培育出在乳腺中特异表达人防御素的转基因奶牛。现在对于体细胞转基因和克隆技术掌握的比较成熟。

2005年pan等发现结核病的发生是与胞内病原体抗性基因1(Ipr1)有关，该研究证明对结核杆菌易感的动物是由于机体没有Ipr1表达，且该基因仅在巨噬细胞中表达(Pan H，et al.Ipr1 gene mediates innate immunity toTuberculosis[J].Nature，2005，434(7034)：767-772)。这为研究防治结核病提供了新的可能：利用体细胞转基因和体细胞克隆相结合的方式，使得缺少Ipr1表达的牛通过生物技术手段实现Ipr1表达，以达到抗结核病的目的。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种包含Ipr1巨噬细胞异性表达载体，以及基于该载体的包含包含Ipr1巨噬细胞异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞系，利用该细胞系作为核供体细胞，为解决奶牛结核病的转基因奶牛提供坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：