[发明专利]鉴定转基因抗虫棉中cry1Aa基因表达框的PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。特别是涉及一种鉴定转基因抗虫棉中cry1Aa基因表达框的 PCR方法及其依赖的表达框序列。

背景技术

自从第一个商业化转基因作物——延迟成熟的番茄Flavr Savr^TM诞生以来，全球转基因作 物的商业化种植发展十分迅猛。2009年全球种植转基因作物的国家达到25个，种植面积总计 达1.34亿公顷，是1996年种植面积的79倍。我国是转基因作物的主要种植国家之一，2009年 种植面积位于全球第六位。我国已经批准商业化种植的转基因作物包括转基因抗虫棉花、抗 木瓜环斑病毒的转基因番木瓜、抗病毒辣椒和延迟成熟的番茄等。其中，转Bt基因(Bacillus thuringiensis)抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物，2009年种植面积达370万公顷，占 我国棉花种植总面积的近70％。我国目前广泛种植的转基因抗虫棉中，已报道的抗虫Bt基因 有cry1Ac基因(Monsanto公司的Mon531转化体)和cry1A(中国农业科学院生物技术研究所的 GK-12等)。

目前，PCR技术是转基因作物检测中应用最为广泛的技术。在应用这种技术进行转基因 作物定性检测时，根据其扩增的靶标区域和特异性将其分为四类：一、筛选检测，以转基因 通用的外源启动子和终止子为靶标区域；二、基因特异性检测，以特异的外源目的基因为靶 标区域；三、构建特异性检测，以转基因元件之间的特异构建为靶标区域；四、转化事件特 异性检测，以转化事件特异性片段(外源插入片段与受体基因组连接区域)为靶标区域。这 四类检测方法对转基因作物的检测特异性是逐渐增加的。构建特异性检测的特异性比筛选检 测和基因特异性检测高，可以区分相同基因与不同启动子和终止子构建方式，可以判断不同 的转基因作物品种是否由相同载体转化而来。

王奕海等报道了检测两种不同Bt表达框的PCR方法(农业生物技术学报，2009，17(5)： 914-919)，建立了鉴别cry1Ac基因(转基因棉33B)和cry1A(转基因棉GK12)构建的PCR方 法。谢家建等(专利申请号：200810225725.5)也报道了这两种基因阅读框的鉴别方法和序 列。但在对现有的专利和文献的分析中发现，还没有任何关于转基因抗虫棉中的cry1Aa基因 表达框序列和对其鉴别方法的文章和专利报道。

发明内容

针对上述领域中的空白，通过从我国种植的转基因抗虫棉中分离获得的cry1Aa基因表达 框序列，提出了鉴定cry1Aa基因表达框的PCR方法，该PCR方法能利用普通的PCR仪器、试剂 快速准确鉴别出转基因棉花中的cry1Aa基因表达框。

转基因抗虫棉中cry1Aa基因表达框序列，如Seq ID No.1所示，其中启动子的序列位于 1-277bp，外源基因cry1Aa的基因序列位于278-2125bp，终止子的序列位于2126-2382bp。

一种鉴定转基因抗虫棉中cry1Aa基因表达框的PCR方法，所述PCR体系中包括一条正向 引物，一条反向引物，其特征在于正向引物设计在Seq ID.No.1的1669-2125bp位置，反向引物 设计在Seq ID.No.1的2126-2382bp位置。

所述正向引物为LM-F：5‘-CCAGATTAGCACCCTCAGAG-3’，

所述反向引物为LM-R：5‘-TTTCCTCGCTCACTATGAGC-3’。

本发明提供的cry1Aa基因表达框序列以及依赖其建立的PCR方法可作为一种鉴定转基因 棉品种中是否具有cry1Aa基因表达框的有效手段，为区分和鉴别转基因棉花品系提供了便利， 该方法的优点在于快速、灵敏度高、特异性好、所需实验条件不高，因此有非常高的实用价 值。

附图说明

图1cry1Aa基因表达框表达框启动子端片段扩增检测电泳图

其中M：Marker DL2000；1-7：鲁棉研15；8：空白对照

图2cry1Aa基因表达框终止子端片段扩增检测电泳图

其中M：MarkerDL2000；1-7：鲁棉研15；8：空白对照

图3本发明的PCR方法鉴定cry1Aa基因表达框

其中M：Marker DL2000；1：鲁棉研15；2-11：10个棉花市场样品；12：空白对照

具体实施方式