[发明专利]糖类的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及糖类的分析方法，特别是涉及采用柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法的还原糖和甘露糖-6-磷酸的分析方法。。

背景技术

作为还原糖的分析方法，已知下述方法：向将水用作流动相使试样经液相色谱而得的洗脱液中加入含精氨酸等碱性氨基酸的硼酸水溶液，进行加热反应后冷却，对该反应液照射激发光并测定荧光强度或吸光度(专利文献1)。该方法中所用的装置是下述装置：将液相色谱的流出管路延长，在该流路上连接含碱性氨基酸的硼酸水溶液的供给路径，其后安装有加热装置、冷却装置、激发光的照射装置和荧光强度等的测定装置。该方法中需要设置用于向经液相色谱而得的洗脱液加入含碱性氨基酸的硼酸水溶液而使其反应的供给路径。

此外，作为上述方法的改良型，已知下述方法：使试样经采用含作为反应试剂的精氨酸等碱性氨基酸和硼酸的流动相的液相色谱进行洗脱，加热所得的洗脱液而使反应试剂与糖类进行反应(加热反应)后冷却，对该反应液照射激发光并测定荧光强度或吸光度(专利文献2)。该方法中，因为采用含碱性氨基酸的硼酸水溶液作为液相色谱的流动相，所以不需要设置用于加入含碱性氨基酸的硼酸水溶液而使其反应的供给路径。上述的还原糖分析法被称为柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法。

上述的还原糖分析法都在检测中利用了还原糖通过在硼酸的存在下与精氨酸等碱性氨基酸的加热反应生成强荧光衍生物的特性(非专利文献1)。该荧光衍生物是通过还原糖与作为胺化合物的碱性氨基酸的加热反应、即美拉德反应而生成的呈褐色的类黑精，该衍生物如果受到作为激发光的波长320nm的光的照射，则发射波长430nm的光。此外，这些还原糖分析法利用了还原糖具有容易与硼酸结合而生成阴离子性配位离子的性质且该阴离子性配位离子被保持于阴离子交换色谱的特性。

柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法中，作为流动相，采用含0.01～5％的浓度的碱性氨基酸和0.05～0.5M的浓度的硼酸的水溶液(pH7～10)。这时所用的碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸等。另外，最近还已知作为液相色谱的流动相使用由0.1M硼缓冲液和0.4M硼酸缓冲液形成的梯度来进行糖的分离(专利文献3、4)。

柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法中，液相色谱中的试样洗脱在室温～70℃的温度下进行，而加热反应、即美拉德反应在140～180℃进行(专利文献2)。因为在这样的高温下以高硼酸浓度进行洗脱和反应，所以有时流动相中所含的硼酸会析出而堵塞管道。管道堵塞时就无法进行分析，因此必须经过管道的更换和清洗等费时费力的操作来重新开始分析。这是柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法中未解决的重要问题之一。

此外，可通过柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法分析的还原糖有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖等单糖，麦芽糖、麦芽三糖等寡糖，葡糖胺、半乳糖胺等氨基糖，葡糖醛酸等糖醛酸。

作为该方法的分析对象，可以例举糖蛋白的糖链。构成糖蛋白的糖链的还原糖有甘露糖、半乳糖、岩藻糖等中性糖和半乳糖胺等氨基糖等。糖链有时还包含甘露糖被1分子的磷酸修饰而得的甘露糖-6-磷酸(M6P)。

糖蛋白的糖链中所含的M6P具有在蛋白质被摄入细胞内时与细胞膜上的甘露糖-6-磷酸受体结合而促进该摄入的重要功能。作为糖链中含M6P的糖蛋白，已知局部存在于溶酶体中的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)等溶酶体酶(非专利文献2)。溶酶体酶中有使用重组技术制成的酶，被用作该酶的遗传性缺失的患者的治疗药，例如α-半乳糖苷酶A和葡糖脑苷脂酶。溶酶体酶由于在细胞内发挥功能，因此为了使通过静脉注射等方法给予患者的溶酶体酶发挥药效，溶酶体酶必须被摄入患者的细胞内，因而需要在溶酶体酶的糖链中包含M6P。因此，进行构成这样的酶的糖链的糖类时，对M6P的分析是特别重要的。柱后荧光检测-硼酸配合物阴离子交换法可以用作各种糖类的分析技术，但尚未确立采用该方法的M6P的分析技术。

专利文献1：日本专利特开昭58-216953号公报

专利文献2：日本专利特开昭61-25059号公报

专利文献3：日本专利特开2006-184131号公报

专利文献4：日本专利特开2008-245550号公报

非专利文献1：Mikami H.等，《分析化学》(1983)32，E207

非专利文献2：Bielicki J.等，Biochem J.(1993)289，241-246

专利文献：

发明内容