[发明专利]一种苏丹红Ⅰ的酶联免疫吸附分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种苏丹红I的半抗原合成及其免疫分析方法。属于免疫分析化学技术领域。

背景技术

苏丹红(Sudan dyes)是一类人工合成的亲脂性偶氮化合物，主要分为四类(I、II、III、IV)，其中苏丹红II、III、IV都是苏丹红I的衍生物。国际癌症研究机构将苏丹红归为三类致癌物，即动物致癌物，目前尚不确定对人类有致癌作用。2003年英国、法国等许多欧盟国家相继发现了进口辣椒和食品中含有苏丹红，引发了全球的“苏丹红”风暴。我国自2005年3月开始，也相继在辣椒调味品、成鸭蛋及唇膏等产品中发现苏丹红，最常见的是苏丹红I和苏丹红IV。

苏丹红残留常规的分析主要是应用高效液相色谱(HPLC)或者高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)等仪器方法在实验室进行。应用这些理化分析技术对食品、生物和环境等样品中痕量苏丹红残留进行分析，不仅仪器化程度要求较高，并且需要经过繁复的分离、提取、净化等前处理过程，分析速度慢、成本高，前处理过程需要使用大量的有机溶剂，容易造成环境污染。许多理化分析技术本身就具有局限性，如苏丹红I的热稳定性差，难于用气相色谱法分析，而液相色谱尚缺乏选择性好的高灵敏度检测器等。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的仪器分析手段难以适应要求，因此，迫切需要开发和应用高效率的苏丹红快速分析技术。

发明内容

本发明针对上述不足，公开了一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的ELISA方法，用于食品中苏丹红I的批量、快速检测。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种苏丹红I的酶联免疫吸附分析方法，其是以人工合成的半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫原制备苏丹红I多克隆抗体；以所述半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联的复合物作为包被抗原，进行竞争性ELISA，其中所述半抗原为4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯甲酸(S1)、4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯丁酸(S2)、4’-(2-羟基-1-萘偶氮基)联苯-4-甲酸(S3)、6-羟基-5-(苯偶氮基)-2-萘甲酸(S4)、2-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)乙酸(S5)和5-(1-苯偶氮基-2-萘氧基)戊酸(S6)中的任意一种。

本发明主要根据苏丹红I的化学结构特点，设计及合成苏丹红I的6种半抗原；再将半抗原与BSA偶联后制备人工免疫原，分别免疫新西兰大耳白兔制备出苏丹红I多克隆抗体。然后以6种半抗原与OVA偶联的复合物作为包被抗原，分别吸附于酶标板孔壁上，用定量苏丹红I做抑制试验，对每种抗体进行筛选，选出抑制效果最好的抗体和包被抗原组合，建立苏丹红I的竞争性ELISA方法。在番茄酱和辣椒粉样品中添加定量的苏丹红I，样品经简单前处理后用建立的ELISA检测，计算准确度和精确度，对ELISA方法进行验证。

本发明的方法，其中所述半抗原通过活性酯法与BSA和OVA偶联。

其中，本发明的6种苏丹红I的半抗原(S1-S6)合成的技术路线如下：

其中，苏丹红I抗体的制备过程中所用的免疫原优选是半抗原S2、S4、S6与BSA的偶联复合物(BSA-S2、BSA-S4和BSA-S6)。包被抗原是所有6种半抗原分别与OVA的偶联复合物(OVA-S1、OVA-S2、OVA-S3、OVA-S4、OVA-S5和OVA-S6)。

最后筛选出抑制效果最好的抗体和包被抗原组合是抗BSA-S2抗体和包被抗原OVA-S1。即苏丹红I多克隆抗体以4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯丁酸与BSA偶联的复合物为免疫原；以4-(2-羟基-1-萘偶氮基)苯甲酸与OVA偶联的复合物作为包被抗原。