[发明专利]用于检测大豆疫霉的引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测大豆疫霉的引物、试剂盒及方法，属于生物技术领域。 

背景技术

由大豆疫霉菌Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，也是我国对外公布的一类检疫对象(许志刚，2003)。大豆疫霉菌可以在大豆生长的各个时期侵染大豆，在潮湿多雨的季节病害发生尤其严重，由于大豆疫霉以同宗配合的方式进行有性生殖，在发病植株上可以产生大量的卵孢子，植物收获后残留在土壤中的卵孢子就成为大豆疫霉的初侵染源，据报道大豆疫霉的卵孢子可以在土壤中存活5年以上(许修宏等，2003)。因此大豆疫霉根腐病一旦发生将很难消除(朱振东等，1999)。 

传统的检测大豆疫霉的方法是进行大豆叶碟诱捕和平板培养或者将二者相结合(Canaday and Schmitthenner，1982；Oudemans，1999；朱振东等，2003；王子迎等，2005)。传统方法在大豆疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验(Tsao，1990；Dobrowolski and O’Brien，1993)，所以很难在生产中推广运用。 

PCR技术具有快速和灵敏的优点，在病原物的鉴定和检测中的地位越来越重要。近年来，一些疫霉菌的PCR检测方法被开发出来。这些方法中设计的引物的来源主要都是转录间隔区(ITS)(Cooke et al.，1995a，b；Bonants et al.，1997；Tooley et al.，1997；Troutet al.，1997；Liew et al.，1998；Tooley et al.，1998；Schubert et al.，1999；Bonants et al.，2000；Judelson and Tooley，2000；Winton&Hansen，2001；Grote et al.，2002；Ippolito et al.，2002)或者elicitin基因(Coelho et al.，1997；Lacourt and Duncan，1997；Kong et al.，2003b)。这些区域或者基因在基因组中都是高拷贝的，所以很容易被检测到。但是越来越多的研究发现，部分疫霉种的ITS序列差异很小，以此为靶标设计的引物难以将这些疫霉菌与其近缘种区分开来。Wang等(2006)根据ITS序列设计大豆疫霉特异性引物时发现，大豆疫霉与P.melonis的ITS序列的相似性高达97％，大豆疫霉的特异性引物3’末端仅仅与P.melonis的相应序列相差1个碱基，需要将退火温度提高到66℃以上才能将这两种疫霉区分开来，但是过高的退火温度会降低PCR反应的灵敏度。而且提高退火温度并不能彻底解决此问题，当P.melonis的浓度较高时仍然会造成假阳性的现象。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测大豆疫霉的引物、包含该引物的检测试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测大豆疫霉准确性高、特异性强、灵敏性高。 

本发明提供的技术方案是：一种用于检测大豆疫霉的引物，即：TrapF1/TrapR1，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述。

一种检测大豆疫霉的试剂盒，包含上述的引物。 

所述的试剂盒，还包含4种dNTP，10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，1％BSA和Taq酶。 

本发明还提供了一种检测大豆疫霉的方法：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果，如果存在长度约为267bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。 

为提高检测的灵敏度，本发明还提供了另一种用于检测大豆疫霉的引物，其包括两对引物，第一对引物即：TrapF1/TrapR1，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物，即：TrapF2/TrapR2，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述。 

本发明还提供了另一种检测大豆疫霉的试剂盒，其包含上述的第一对引物和第二对引物。