[发明专利]一种甲型H1N1病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种甲型H1N1病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

甲型H1N1流感于2009年爆发时，最初世界卫生组织使用了“猪流感”(swine flu)的名称。现在，WHO已开始使用“甲(H1N1)型流感”代替“猪流感”来指代当前疫情，我国卫生部公告中则将这一疾病称为“甲型H1N1流感”。甲型H1N1流感病毒是A型流感病毒，携带有H1N1亚型猪流感病毒毒株，包含有禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的核糖核酸基因片断，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。

甲型H1N1的临床表现为潜伏期一般1至7天左右，较流感、禽流感潜伏期长。其早期症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。部分患者病情可迅速进展，来势凶猛、突然高热、体温超过39℃，甚至继发严重肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾功能衰竭、败血症、休克及Reye综合征、呼吸衰竭及多器官损伤，导致死亡。若患者原有的基础疾病亦可加重。

面对甲型H1N1流感，保护自己和他人在预防方面，没有必要扎堆去接种人流感疫苗，因为预防季节性流感疫苗对预防甲型H1N1流感并无效果。正确的做法是养成良好的个人卫生习惯，充足睡眠、勤于锻炼、减少压力、足够营养；勤洗手，尤其是接触过公共物品后要先洗手再触摸自己的眼睛、鼻子和嘴巴；打喷嚏和咳嗽的时候应该用纸巾捂住口鼻；室内保持通风等。

卫生部2009年4月30日印发的《人感染猪流感诊疗方案(2009版)》中指出，人感染猪流感的诊断主要结合流行病学史、临床表现和病原学检查等，临床上早发现、早诊断是治疗的关键。近年来的发展起来针对甲型H1N1病毒的荧光定量PCR(FluorescenceQuantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点在甲型H1N1病毒的基因检测水平上有着广泛的应用，是目前甲型H1N1检测的主要方法，目前国内市场上已经有了关于甲型H1N1核酸定量检测试剂盒。

FQ-PCR虽然有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器，且容易造成假阳性等问题。

交叉引物扩增法是一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计6种(三对)特异引物，引物尾端交叉互换序列，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、多次温度循环等过程，此交叉引物恒温扩增靶核苷酸序列的方法及其应用本申请人之前已申请专利(申请号：200810134583.1)。在此方法的基础上制备了本发明的甲型H1N1病毒的恒温扩增检测试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种甲型H1N1病毒的恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒特异性好，灵敏度高，步骤简单，反应速度快。

本发明所提供的甲型H1N1病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒，包括下列组成：

(1)RNA提取液：RNA提取试剂盒；

(2)恒温扩增反应液：

包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermolbuffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

正向外围引物序列为5’-AATAACATTCGAAGCAACTGG-3’(SEQ ID NO1)；

反向外围引物序列为5’-AAATAGGCCTCTAGATTGAAT-3’(SEQ ID NO2)；

所述的两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5’-biotin-ATAATACCAGATCCAGCATT-3’(SEQ IDNO3)；

反向3’端异硫氰酸荧光素FitC标记探针5’-AAAAGCACAAAATTGAGAC-FitC-3’(SEQ ID NO4)；

所述的扩增交叉引物分别为：

扩增反向引物5’-GATATGCATTCGCAATGGAATTCCTCAATCCTGTDGCCA-3’(SEQ IDNO5)；

扩增正向引物5’-TTCCTCAATCCTGTDGCCAGATATGCATTCGCAATGGAA-3’(SEQ IDNO6)；

(3)阳性对照模板：为含有甲型H1N1病毒HA基因片段的转录产物。

(4)阴性对照：无菌双蒸水。