[发明专利]精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及瓜氨酸的制备方法，具体涉及一种利用本公司研发的精氨酸发酵菌种Ac189-20所产生的含L-精氨酸发酵液经恶臭假单胞菌Ac88转化为L-瓜氨酸的方法。

背景技术

L-瓜氨酸是一种具有广泛应用潜力的特种氨基酸，是公认的用途最广泛的天然氨基酸之一。它在人体内直接代谢产物为精氨酸(体内产生一氧化氮的唯一前体)，具有增强人体免疫力，维持关节健康、壮阳、平衡血糖、吸收有害自由基和降低胆固醇等功效，因而被广泛用于保健品或食品添加剂。

现有的瓜氨酸的生产方法都是使用含有精氨酸脱亚氨基酶的菌体，例如粪肠球菌、恶臭假单胞菌等，使用游离菌体或者菌体固定化的方法把L-精氨酸成品转化为L-瓜氨酸，因而使瓜氨酸的成本受制于精氨酸成品的价格。目前还尚未见有直接发酵法生产瓜氨酸的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法。利用精氨酸发酵法和瓜氨酸酶转化法联合制备瓜氨酸是目前最接近于发酵法直接制备瓜氨酸的工艺路线，本发明由精氨酸的发酵液直接转化为瓜氨酸，从而合并了两种氨基酸的纯化过程，减少了纯化的损失，提高了产品收率，使得瓜氨酸的生产成本大大降低。

本发明的精氨酸发酵联合酶转化制备瓜氨酸的方法，利用含有精氨酸脱亚氨基酶的菌液投入含有精氨酸的发酵液，将发酵液中的精氨酸直接转化为瓜氨酸，最后分离纯化得到合格的瓜氨酸。具体包括以下步骤：

1)精氨酸发酵液的制备

利用本公司研发的精氨酸发酵菌种Ac189-20，(谷氨酸棒杆菌，Corynebacterium glutamicum，微生物保藏号：CGMCC No.3693，保藏时间：2010年3月25日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)发酵产生含精氨酸60～80g/L的发酵液。

其中，种子培养基配方：葡萄糖3wt％、KH₂PO₄0.05wt％、K₂HPO₄·3H₂O0.15wt％、(NH4)₂SO₄0.5wt％、MgSO₄·7H₂O 0.04wt％、维生素H(VH)25μg/L、玉米浆(C.S.L)3-5wt％、酵母膏0.5wt％、脲0.10wt％。

发酵培养基配方：葡萄糖12.5wt％、(NH4)₂SO₄4wt％、脲0.1wt％、KH₂PO₄0.15wt％、K₂HPO₄·3H₂O 0.05wt％、维生素H(VH)50μg/L、V_B11mg/L、玉米浆(C.S.L)4wt％、酵母膏0.2wt％、泡敌(聚醚3010)万分之1～千分之1。

发酵条件：pH：6.7～7.0，溶解氧：20％～25％(以发酵前溶氧值为100％计)，流加补糖，发酵周期78小时，发酵液中精氨酸含量60～80g/L。

2)含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体的培养

利用本公司研发的菌种Ac88(恶臭假单胞菌，Pseudomonas putida，微生物保藏号：CGMCC No.3694，保藏时间：2010年3月25日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址：背景市朝阳区北展西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)制备含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体。

其中，培养基配方：葡萄糖2wt％，蛋白胨1wt％，酵母膏2wt％，精氨酸0.5wt％，磷酸氢二铵0.5wt％，磷酸二氢钾0.1wt％。

培养条件：pH：6.4，溶解氧：5％～15％(以发酵前溶氧值为100％计)，发酵周期30小时(包括种子罐)。

菌体分离：将上述培养好的发酵液，经0.2μm的陶瓷膜过滤器过滤，使湿菌体体积为总发酵液体积的20％，即得到含精氨酸脱亚氨基酶的恶臭假单胞菌湿菌体。

3)精氨酸直接转化瓜氨酸

将步骤2)得到的恶臭假单胞菌湿菌体按湿菌体对需转化的精氨酸发酵液1∶25～30体积比，投入步骤1)得到的含精氨酸的发酵液中，并加入总体积0.05wt％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为催化剂进行酶转化，即得到含有瓜氨酸的发酵液。