[发明专利]1千亿活芽胞每克多粘芽胞杆菌原粉的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及污染水体净化、垃圾除臭等领域，更具体涉及一种多粘芽胞杆菌原粉(1,000亿活芽胞/克)的制备方法，将在饲料工业和水产养殖方面上得到广泛应用。随着芽胞杆菌功能还在不断地被发现，应用范围也在不断扩大，在国内国际市场上有很强的竞争力。

背景技术

自20世纪50年代以来，抗生素作为疾病治疗剂和动物生长促进剂发挥了重大作用。然而，由于抗生素负面效果越来越严重，世界卫生组织已禁止在饲料中使用任何抗菌药物，一些发达国家对兽用抗生素的使用也有明确规定。饲料和养殖业以添加抗生素预防和促进动物生长的饲养方式已经受到了很大冲击，抗生素替代品的使用和推广成为养殖业发展的必然方向。芽胞杆菌益生菌具备抗生素预防疾病和促进生长的特点，成为抗生素的替代品，将取得理想的应用效果，在养殖业中具有很大的开发潜力。

益生菌又称微生态制剂，是指有益微生物经过特殊驯化和加工制成的活菌制剂，益生菌可以改善动物肠道中微生物的菌群平衡，防治某些细菌性疾病的发生，能提高动物的饲料利用率、提高机体免疫力，促进生长和改善生产性能，得到安全无药物残留的动物产品。现已开发成商品制剂的益生菌有：芽胞杆菌类、酵母、乳酸菌、双歧杆菌、链球菌、曲霉等。

目前，国内芽胞杆菌益生菌制品的生成工艺主要有两种，即固体发酵法和液体深层发酵法。固体发酵法是把益生菌接种到固体培养基上进行发酵培养，其优点是相对管理比较粗放，具有生产工艺简单，投资少的特点，但同时具易受杂菌污染，菌体含量不易控制、产品质量不稳定的缺点。目前我国大多数芽胞杆菌益生菌产品都是采用该生产方法。液体深层发酵法是采用现代发酵技术，将益生菌菌种接种到反应器中进行通风培养，对整个发酵过程都可以进行精细的过程控制，具有便于无菌操作，容易控制菌体含量，产品质量稳定的特点，但技术水平要求较高，相对固体发酵投资要高，但更适合工业化生产。其一般工艺流程为：菌种接种培养→种子罐培养→发酵罐发酵培养→排放培养液→收集菌体→加入适量载体和保护剂→干燥→粉碎→过筛→稀释混和→成品包装→质检→益生菌产品。

国内通常采用的固体发酵方式生产的多粘芽胞杆菌制剂一般不形成芽胞。采用本工艺生产的多粘芽胞杆菌原粉(原药)具有生产清洁安全、回收率高、产品芽孢数稳定、产品活芽胞数达1,000亿活芽胞每克等优点。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种1千亿活芽胞每克多粘芽胞杆菌原粉的制备方法，本发明方法易行，操作简便，安全、高效优质，由该工艺生产的多粘芽胞杆菌原粉(原药)中的活芽胞数达1,000亿活芽胞每克。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

多粘芽胞杆菌培养基优化及液体高密度补料发酵技术；高效的芽胞提取回收工艺，产品活芽胞数高。

一种多粘芽胞杆菌原粉的制备方法，其步骤是：

1.高产CGMCC 1.224的培养基优化：

采用Box-Behken设计的响应面实验，首先从众多因子中选择重要的部分因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑碳源、氮源、无机离子等多个因素之间的协同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Steepestascent)，和用于优化响应面最大值的中心组合设计(Central Composite Design)来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过对回归方程的分析，设计优化B-53发酵培养基(大米粉25.31g/L，葡萄糖17.75g/L，酵母粉26.55g/L，豆粕5.91g/L，花生粕6.21g/L，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1.75g/L，氯化锰(MnCl₂)0.09g/L，硫酸镁(MgSO₄)0.05g/L)。

2.液体深层高密度补料发酵技术提高发酵生物量：

采用Box-Behken设计的响应面实验优化的发酵培养基B-53进行分批发酵动力学研究，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH、芽胞数为指标，确定各时期迟缓期、对数生长期和稳定期最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞形成关系。在分批发酵研究基础上，优化高密度补料发酵工艺，在分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，采用糖浓度15g/ml，通过补加葡萄糖，使发酵过程还原糖浓度为0.5-1.0％(质量比)，发酵过程共用葡萄糖5％(质量比)；，发酵过程补加氨水，使pH控制在6.8-7.2范围，发酵液活芽胞数达25亿/ml；

3.特殊、高效的芽胞提取与回收工艺：