[发明专利]一种枯草芽胞杆菌及1万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉的制备方法

权利要求书

1.一种枯草芽胞杆菌，其特征在于：枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)KN-48，CCTCCNO：M209317。

2.权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌原粉的制备方法，其步骤是：

A.BsKN-48菌种的筛选：取土壤和水体中的样品，在已灭菌的研钵内研磨均匀，称取研磨好的土样装入无菌试管中，加入10mL无菌水充分震荡，制成1∶10的土壤稀释液，从上述溶液中取出1mL，加入无菌水震荡做成1∶10²的稀释液，依此类推，制成1∶10³、1∶10⁴、1∶10⁵、1∶10⁶的土壤稀释液，用移液枪吸取稀释液涂布在分离培养基上，于29-31℃温控培养箱中培养3-5d后，挑出芽胞同步的菌株，经革兰氏染色后显微镜检，选出有Bs形态特征的菌株转接到液体摇瓶发酵培养基中，500mL摇瓶装量为25mL，摇床转速为200rpm，30℃摇瓶培养后，选出生长的菌种转接到试管斜面生长后于4℃保种；

(1)A₁分离培养基：豆饼粉30g，淀粉8g，酵母粉10g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸锰0.05g，碳酸钙0.1g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.5，121℃灭菌30min；

(2)B₁液体摇瓶发酵培养基：大米粉30g，麦麸15g，硫酸镁0.03g，硫酸亚铁0.002g，硫酸锌0.02g，碳酸钙1g，水1000mL，pH 7.0-7.5，121℃灭菌30min；

B.对BsKN-48菌株进行了形态和生理生化特征研究，测定BsKN-48菌株的16SrDNA共1244个有效碱基，根据枯草芽孢杆菌在Genebank中的16SrDNA序列进行分子鉴定，结合系统发育资料及分类资料鉴定KN-48菌株为枯草芽胞杆菌；

C.BsKN-48的培养基：采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数为筛选指标，利用单因子实验首先从碳源、氮源、微量元素因子中选择因子筛选设计，采用多元一次和二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系得到回归方程，通过对回归方程来设计培养基B-48；

(1)、碳源因子：通过单因子实验，从玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉或玉米粉中筛选出大米粉和玉米淀粉为BsKN-48碳源需求因子；

(2)、氮源因子：通过单因子实验，从水解植物复合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬氨酸或硫酸铵中筛选出酵母粉、豆粕和玉米浆为BsKN-48氮源需求因子；

(3)、微量元素因子：通过单因子实验，从氯化钴、碳酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸亚铁、氯化锰、硫酸铜或硫酸锌中筛选出磷酸二氢钾、硫酸镁和氯化钠为BsKN-48微量元素需求因子；

(4)、利用PB实验设计筛选影响BsKN-48芽胞形成的重要因子，确定大米粉、玉米淀粉和酵母粉为重要因子，利用SAS软件设计中心组合实验，得到BsKN-48发酵配方B-48：大米粉28.84g/L，玉米淀粉18.21g/L，酵母粉27.92g/L，玉米浆30.05g/L，豆粕3.88g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.06g/L，氯化钠3g/L，碳酸钙1g/L，发酵液活芽胞数达100亿/ml；

D.高密度液体补料发酵技术提高发酵生物量：采用Box-Behken设计的响应面实验的培养基进行分批发酵，以发酵前期，对数期，稳定期OD、溶氧、pH值、芽胞数为指标，确定营养平衡，及与芽胞数关系，在分批发酵配方上进行碳源和氮源浓度加倍，采用糖浓度10g/ml，通过补加葡萄糖，使发酵过程还原糖浓度为0.5-1.0％质量比，发酵过程共用葡萄糖7％质量比；发酵过程补加氨水，使pH控制在6.8-7.2范围，发酵液活芽胞数达150亿/ml；

E.芽胞提取与回收工艺：发酵罐酸化：2N稀盐酸，PH4.2，升温35℃，80目过滤，加3.18‰质量比硫酸锌，搅拌3分钟，再加2.27‰质量比黄血盐，搅拌1分钟，静置15分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200℃，出口风温85-87℃，原粉活芽胞数达10,000亿/克；

F.活芽胞数检测：

称取0.99g～1.01g试样到中性瓶中，加入100mL，0.85％质量比的生理盐水，摇动混合均匀，再把混合瓶放在磁力搅拌器平台上混合30min后，放入超声波水浴器中超声15min，然后再放在匀质器中混合10min，将处理的试样溶液依次稀释到10^-8放入70℃水浴锅中水浴30min，然后稀释到10^-9取0.1mL到每个营养琼脂培养基平板中，用涂棒把试样溶液均匀涂布后，放在37℃恒温培养箱中培养16hr～20hr。