[发明专利]抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体，其特征在于，所述小羊驼VHH重链抗体选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体，其特征在于，所述的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列分别编码具有SEQ IDNO.11～SEQ ID NO：20所示氨基酸序列的蛋白。

3.一种如权利要求1或2所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)小羊驼免疫和血凝抑制效价检测，淋巴细胞分离，细胞总RNA抽提，cDNA合成；

(2)构建抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体库，包括：

a)设计引物；

b)优化PCR条件进行PCR反应；

c)载体酶切处理及连接步骤B形成的抗体基因片段；

d)将步骤C的连接产物及制备的电转化感受态细菌一起电转化得到抗H5N1型禽流感小羊驼VHH型抗体库；

(3)优化的抗体库的固相筛选，包括：

a)在步骤(2)构建的抗H5N1型禽流感小羊驼VHH型抗体库中加入噬菌体进行培养，呈现噬菌体抗体库；

b)噬菌体滴度的测定；

c)在噬菌体抗体库中筛选噬菌体展示抗体；

d)噬菌体ELISA鉴定阳性克隆。

4.如权利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)的步骤A中所述设计引物具体为：

根据引导肽序列设计保守引物LP-leader：5-GTGGTCCTGGCTGCTCTW(SEQ IDNO.21)；

在恒定区CH2区域设计保守引物GSP-RT：5-CGCCATCAATRTACCAGTTGA-3(SEQ IDNO.22)；

在可变区FR1区域的序列信息上设计兼并引物AlpVhFR1-SfiI-MA：cctttctatgcGGCCCAGCCGGCC ATG GCC CAG KTG CAG CTC GTG GAG TCN GGN GG(SEQ IDNO.23)；

根据长铰链序列设计保守引物Long-NotI：aaggaaaaaa GCGGCCGC TGG TTG TGG TTTTGG TGT CTT GGG TT(SEQ ID NO.24)；

根据短铰链序列设计保守引物Short-NotI：aaggaaaaaa GCGGCCGC GCT GGG GTCTTC GCT GTG GTG CG(SEQ ID NO.25)。

5.如权利要求3所述的抗H5N1型禽流感病毒的小羊驼VHH重链抗体的制备方法，其特征在于：步骤(2)的步骤B具体为：

1)将合成的cDNA、pfu缓冲液、dNTP、引物LP-leader、引物GSP-RT、pfu聚合酶及水在如下PCR条件下进行PCR反应：94℃预变性3min；然后按以下条件进行30个循环反应，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s；最后72℃延伸5m；琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物；

2)将步骤1)的PCR产物、pfu缓冲液、dNTP、引物AlpVhFR1-SfiI-MA、引物Long-NotI或Short-NotI、pfu聚合酶及水在如下PCR条件下进行PCR反应：94℃预变性3min；然后按以下条件进行20个循环反应，94℃ 40s，62℃ 40s，72℃ 40s；最后72℃延伸5min；分别割胶回收长铰链片段和短铰链片段，部分样品加A处理后，克隆、验证、测序。