[发明专利]用于核酸序列检测的方法和试剂盒

权利要求书

1.用于检测样品中所含有的多核苷酸分析物中靶序列存在情况的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在有效形成分析物与探针的双链复合物的条件下，将样品与靶标探针混合，所述靶标探针含有能与靶序列杂交的序列；

(b)在存在聚合酶及四种可能核苷三磷酸中选定的一至三种的情况下使该复合物中的探针发生反应，从而向该探针的3′末端添加一个或多个由靶标指导的核苷酸碱基，以产生经修饰探针；

(c)使所述经修饰探针与检测探针杂交，其中该检测探针不与靶标杂交，且这两种探针中的至少一种具有粘末端，所述粘末端具有与另一探针3′末端或5′末端的单链部分互补的单链部分；

(d)通过该反应将所述两种探针连接起来，以形成两探针连接产物；和

(e)检测该连接产物的存在情况。

2.权利要求1的方法，其中步骤(b)包括通过变性或者降解靶标使所述经修饰探针从靶标上解离的额外步骤。

3.权利要求1的方法，其中在步骤(b)的聚合反应之前或之后所述靶标探针具有粘末端，该粘末端的单链部分含有一个或多个核苷酸。

4.权利要求1的方法，其中步骤(c)的检测探针和经修饰探针均为具有彼此互补的粘末端的单链多核苷酸，并且步骤(d)中形成的所述两探针连接产物为环状单链多核苷酸。

5.权利要求4的方法，其中步骤(d)包括在连接反应后消化任何线性探针及靶标的额外步骤。

6.权利要求1的方法，其中步骤(a)中靶标探针的量以摩尔计显著地过量于靶标分析物的量，并且该方法还包括重复进行步骤(a)和(b)以增加所述样品中存在的经修饰探针，所述重复进行步骤(a)和(b)包括在每个步骤(b)之后加热样品以从所述靶标多核苷酸上释放经修饰探针，以及包括作为每个步骤(a)之一部分的使样品冷却，以使未反应的靶标探针与所述靶序列杂交。

7.权利要求1的方法，其用于检测1至6个碱基的目的靶标区，例如SNP或位置已知的点突变，其中所述靶标探针具有与所述目的靶标区部分互补或毗邻该目的靶标区的3′末端核苷酸碱基，并且其中进行步骤(b)以使所述经修饰探针的3′末端序列与所述目的靶标区互补。

8.权利要求7的方法，其用于检测样品中一种或多种多核苷酸中的多个目的靶序列，其中将所述样品与多种靶标探针混合，每种靶标探针均为单链多核苷酸，其具有能与样品多核苷酸的某区域形成双链复合物的发夹环结构，其中步骤(a)包括将该样品分成两个或更多个样品等分试样，并将每个样品等分试样与所述多种靶标探针混合，步骤(b)包括在聚合酶存在下使每个样品等分试样与四种不同核苷三磷酸中选定的一至三种发生反应，每个等分试样使用四种不同核苷三磷酸中一至三种的不同组合，步骤(c)包括使所述经修饰探针与等分试样特异性检测探针杂交，步骤(d)包括通过反应使该经修饰探针与等分试样特异性检测探针连接，形成连接产物，步骤(e)包括在检测前扩增每个等分试样的连接产物。

9.权利要求8的方法，其中步骤(e)包括在通过与附着在固体表面上的探针杂交来进行检测之前混合每个等分试样的额外步骤。

10.权利要求8的方法，其中所述多种靶标探针在反应管中在固体表面合成，从固体表面上释放所述多种靶标探针形成了多种靶标探针的混合物。

11.权利要求8的方法，其中步骤(e)包括在检测前将每个等分试样中的连接产物分成两个或更多个等分试样并用特异性引物扩增每个等分试样的额外步骤。

12.权利要求1的方法，其中所述检测连接产物的存在情况包括使用该连接产物作为模板进行扩增，以产生可检测的扩增子。

13.权利要求1的方法，其中所述靶标探针或检测探针之一附着在固体支持物上，步骤(d)中产生的连接产物也附着在该固体支持物上，检测连接产物存在情况的步骤(e)包括检测该连接产物在该支持物上的存在情况。

14.权利要求1的方法，其用于蛋白质结合测定，其中所述多核苷酸分析物负载在蛋白质结合剂上。