[发明专利]小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种口岸检验检疫、农业生产、植物保护领域检测用的标准分子，特别是涉及一种小麦印度腥黑穗病菌检测用标准分子及其制备方法。

背景技术

小麦印度腥黑穗病菌(Tilletia indica Mitra异名Neovossia indica(Mitra)Mundkur)是一种扩散较快、危害性很大的病原真菌，已有40多个国家将其列为检疫性有害生物(OEPP/EPPO，1980；CABI/EPPO，1992)。迄今为止，除原产地印度外，该病已在巴基斯坦、伊拉克、尼泊尔、阿富汗、墨西哥、南非和美国等地都有报道(Warham，1986；Singh et al.，1989；Bonde et al.，1997)，成为威胁世界小麦生产和贸易的最具危险性的真菌病害之一。

小麦印度腥黑穗病菌主要危害小麦(Triticum aestivum L.)，也可以危害硬质小麦(T.durum Desf.)。它不仅能引起小麦减产，使一些田块的损失高达89％(Matsumoto et al.，1989)，还降低小麦种子的萌发率(Goel et al.，1992)，而且更重要的是影响小麦的品质(Singh et al.，1990)。小麦印度腥黑穗病的症状在田间不易被发现(Bonde et al.，1997)，通常对寄主造成局部侵染，沿腹沟在种皮下产生粉状孢子堆，在籽粒表面形成疱斑；只有感染严重时病粒的大部分或全部形成黑粉腔(Zhang et al.，1984)。

对小麦印度腥黑穗病菌的鉴定，早期主要在于比较小麦印度腥黑穗病菌和水稻腥黑粉菌之间的区别。Aggarwal等、Peterson等分别对小麦印度腥黑穗病菌冬孢子形态特征进行研究，并建立形态学鉴定方法，但由于这些方法未包括美国于1997年报道的黑麦草腥黑粉菌，从而使该方法失去了应用价值。Castlebury等对小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草上腥黑粉菌(当时还未定名)等近似种进行了比较形态学研究，认为小麦印度腥黑穗病菌与黑麦草上的腥黑粉菌冬孢子则在大小和颜色上较为接近。章桂明等对小麦印度腥黑穗病菌及其近似种在光学显微镜和扫描电镜下冬孢子的形态特征进行了比较，认为小麦印度腥黑穗病菌与黑麦草腥黑粉菌非常接近，只获得少量孢子的情况下难以从形态学方面将两菌区别。1997年后，对小麦印度腥黑穗病菌检测方法的研究主要集中在区分小麦印度腥黑穗病菌与黑麦草腥黑粉菌。

在实际检测过程中分子检测方法需要设置阳性参考物质对照，以作为检测结果判定和评价以及质量控制的依据，对分子检测方法有重要意义。现阶段小麦印度腥黑穗病菌分子检测方法研究中所用的阳性参考物质通常是小麦印度腥黑穗病菌的基因组DNA。其抽提过程较复杂，制备不方便，抽提的基因组DNA稳定性也不能满足长期及经常性使用的需要，并且由于不同检测方法或检测实验室间所用的基因组DNA质量存在差异，从而制约了小麦印度腥黑穗病菌检测标准及其它分子检测方法的推广应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种制备简便、特异性强、具有良好均匀性和稳定性的小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子。

本发明的另一目的在于提供上述标准分子的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述标准分子的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子，所述标准分子为能够进行复制的质粒，且所述质粒含有以下序列A和序列B中的至少一种，

所述序列A与Genebank中编号为AF218059的序列99.56％同源；

所述序列B与Genebank中编号为AF399888的序列99.85％同源；。

在本发明具体的实施方式中，所述序列A为Seq ID No.1所示的序列，所述序列B为Seq ID No.2所示的序列。

所述质粒优选为T载体，更优选为pMD19-T。

本发明还公开了上述小麦印度腥黑穗病菌检测标准分子的制备方法，所述方法包括：以小麦印度腥黑穗病菌DNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增的引物包括下述引物对a和引物对b中的至少一对，将扩增得到的DNA序列转化质粒，

引物对a：

Seq ID No.3：5′-TGGGCTGAGTCTGAGATGC-3′

Seq ID No.4：5′-AGTAATACCTGCGTCTCATAGC-3′

引物对b：

Seq ID No.5：5′-TAGGTACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′