[发明专利]快速筛选嗜热厌氧产乙醇微生物高产乙醇菌株的方法

权利要求书

1.一种快速筛选嗜热厌氧产乙醇微生物高产乙醇菌株的方法，主要步骤如下：

1)将野生型菌株在含有乙醇的液体培养基中连续培养，定向进化嗜热厌氧产乙醇微生物的乙醇耐受性；

2)对耐受乙醇的菌株进行甲基磺酸乙酯诱变，将诱变后的菌液涂布到含有乙醇的固体培养基上；

3)待形成单菌落后，选择菌落半径大的单菌落滴加2，3，5-三苯基氯化四氮唑显色液，取显色颜色深的单斑到含有高底物浓度的CaCO₃复筛平板上进行复筛；

4)选择菌落半径大但透明圈半径小的菌落，滴加pH指示剂排除假阳性；

5)发酵后用气相色谱或乙醇定量试剂盒测定乙醇浓度，选择乙醇产量高的菌株在非选择条件下培养至少20代，仍能保持高乙醇产量的菌株即为目的菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1中的嗜热厌氧产乙醇微生物是指最适生长温度高于50℃、严格或兼性厌氧、存在产酸和产乙醇代谢途径的革兰氏阳性菌，主要包括：嗜热厌氧产乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、布氏嗜热厌氧细菌(Thermoanaerobiumbrockii)、嗜热硫化氢梭菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)和嗜热解糖梭菌(Clostridiumthermosaccharolyticum)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1中乙醇定向进化的耐受终浓度按体积浓度计为2％-15％。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2中甲基磺酸乙酯工作浓度按体积浓度计为0.1％-5％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3中2，3，5-三苯基氯化四氮唑中乙醇终浓度按体积浓度计为3％-16％。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤3中2，3，5-三苯基氯化四氮唑浓度为1-100mg/ml。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3中复筛平板含有0.1-2g/LCaCO₃，1-10g/L葡萄糖。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤5中非选择条件下培养至少20代仍能保持乙醇产量按体积浓度计在2％以上。