[发明专利]一种应用于核酸序列分析中的核酸聚合酶链式反应的改进方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种核酸聚合酶链式反应的改进方法，主要应用于核酸序列分析和遗传分析。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外核酸扩增系统，该系统能在体外将DNA片断短时间内迅速扩增，在核酸序列分析中得到广泛应用。

在核酸序列分析中，目前广泛采用Sanger创立的双脱氧链终止法为基础的方案，利用DNA在体外通过聚合酶链反应的合成过程中，当双脱氧核苷酸参与后，DNA链合成会被终止，并产生一系列长度不等，末端不同的单链DNA片断，经过电泳分离后，可读出不同长度的相关片断。通用的商品化的试剂盒提供了将荧光染料嵌入双脱氧核苷酸上，用激光诱导检测经电泳分离后的DNA核酸片断的方法。但采用的试剂价格非常昂贵。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计减少核酸聚合酶链式反应中试剂的用量，降低核酸测序的成本的方法。

本发明提供了一种应用于核酸序列分析中的核酸聚合酶链式反应的改进方法。

本发明的一种应用于核酸序列分析中的核酸聚合酶链式反应的改进方法，通过向PCR反应体系中加入大量与水不相溶，密度比水小的惰性溶剂将反应体系覆盖，来实现对聚合酶链反应的优化。

本发明方法包括以下步骤：

(1)PCR反应：

a、向PCR反应体系中加入大量与水不相溶，密度比水小且沸点比水高的惰性溶剂，将PCR反应体系完全覆盖，可将PCR反应体系的体积缩小，反应体系中各组分的浓度不变；

b、将反应体系离心后，然后进行PCR反应，条件为：在75℃条件下预热3分钟；45个循环，每个循环包括：95℃变性10秒，50℃退火20秒，60℃延伸4分钟。

(2)PCR产物的纯化：

a、在PCR反应后，向反应体系中加入缓冲液，缓冲液成分为：2mmol/L MgCl₂，80mmol/L Tris，pH值为9；

b、再采用乙醇沉淀法进行纯化。

(3)PCR产物的检测，对PCR产物进行检测采用毛细管电泳核酸测序仪，获取检测谱图。

所述步骤(1)的惰性溶剂为与水不相溶，密度比水小，沸点比水高，如石蜡油等，惰性溶剂的体积为PCR反应体系的3-10倍，PCR反应体系的体积在0.5μL-3μL。将PCR反应体系的体积缩小，反应体系中各组分的浓度不变。

所述的PCR反应体系参见各种用于核酸序列分析的PCR反应体系，如：ABI公司的BigDye v3.1体系，PCR反应体系(10uL反应体系)的成分为：1-4uL BigDye，0-3uL的2.5X缓冲溶液，10pmol引物，250-500ng的DNA模板，加去离子蒸馏水至10uL。

所述步骤(2)在反应体系中加入的缓冲液的体积为惰性溶剂体积和反应体系体积之和的1-2倍；缓冲液为2mmol/L MgCl2(氯化镁)，80mmol/L tris(三羟甲基氨基甲烷)。

所述步骤(3)毛细管电泳核酸测序仪为Applied Biosystems公司的310，3100，3130，3130xl，3700，3730或者3730xl核酸序列分析仪。

所述步骤(3)乙醇沉淀法进行纯化方法如下：

a.加入150μl混合溶液(1-丁醇：无水乙醇，35％：65％，v/v)；

b.用移液枪吸入压出混合，确保反应产物完全分散在混合溶液中；

c.室温下离心30分钟，离心力为3500*g；

d.将PCR管倒扣在净化无尘滤纸上除去上清液；

e.将PCR管翻转后放回离心机，室温下离心1分钟，离心力为500(×g)；

f.加入150μl洗液，洗液成分为：65％无水乙醇：35％0.1mM EDTA(乙二胺基四乙酸)，室温下离心10分钟，离心力为3,500(×g)；再将PCR管倒扣在净化无尘纸上除去上清液；

g.将步骤e和步骤f重复操作一次；

h.将PCR管放回离心机，室温下离心1分钟，离心力为500(×g)；干燥后，用上样缓冲液DNA II(Applichem公司)重新溶解，即可进行分析。

本发明操作简便，在不影响核酸序列检测的前提下减小PCR反应中各种试剂的用量，避免直接稀释反应体系导致PCR产物检测时信号的显著下降，降低成本，有较高的应用价值。