[发明专利]一种鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别接种了A型流感“标记”疫苗动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，具体涉及一种检测A型流感病毒NA蛋白血清抗体的间接免疫荧光试验方法，是A型流感“标记”疫苗的配套检测方法。

背景技术

A型流感，如H5N1亚型禽流感、H1N1甲型流感是一种严重的人畜共患病，既可给养禽业造成巨大的经济损失，又可以导致人的死亡，在世界许多国家流行，其中包括我国。经典的预防A型流感(如禽流感H5N1亚型)的措施包括采取严格的生物安全措施、限制有感染流感病毒风险动物的移动，扑杀感染病毒的动物。疫苗接种是防控流感的一种非常有效地手段，尽管免疫接种能提高动物的抵抗力，使免疫动物不表现出临床症状和感染动物减少排毒数量，但并不能完全阻止病毒的感染，也就是说接种了疫苗的动物接触到病毒后，可能成为健康的带毒者。所以，作为免疫接种的配套手段，需要严密的监测接种了疫苗的动物，检测动物群是否存在健康带毒禽，以便采取相应的措施，以防病毒随着带毒动物的移动而向外传播，更不利于该病的控制。

鉴别免疫动物，如禽、猪等是否携带A型流感病毒历来是动物疫病防控措施难点，尤其是通过检测抗体进行鉴别诊断。一个有效方法是给动物，如禽、猪等免疫接种“标记”疫苗，然后针对疫苗的“标记”，检测相应蛋白抗体，可鉴别诊断出免疫动物是否感染A型流感病毒。例如给鸡接种表达H5N1病毒HA基因的重组鸡痘病毒疫苗或用与流行病毒(H5N1)不同NA亚型的病毒(H5N3)制备灭活疫苗等，通过检测血清中N1蛋白抗体(这种抗体只有病毒能够诱导产生，而“标记”疫苗不能产生)判定免疫了“标记”疫苗的鸡是否感染H5N1亚型流感病毒，一旦检测到N1抗体就表明该禽感染了禽流感病毒(H5N1亚型)。

现有技术中一般采用“哨兵”动物，来判定免疫动物群是否感染A型流感病毒。所谓的“哨兵”动物是指没有免疫的动物，即不含有相应A型流感病毒的抗体。把“哨兵”动物随机放到免疫动物群中，经过与免疫动物接触一段时间，检测“哨兵”动物血清中相应亚型流感病毒的抗体，如果为阳性，则判定该动物群有相应亚型流感病毒流行。用“哨兵”动物来判定免疫动物群是否感染A型流感病毒存在以下缺点：

1.成本高。“哨兵”动物必须是无特定病原动物，即不能含有某种病原，如A型流感病毒，才能作为“哨兵”动物，在使用“哨兵”动物前，必须饲养在特殊的环境中，因此，“哨兵”动物的成本很高，而且在使用时需要投放一定数量。

2.难以大范围使用。为了鉴别动物群是否感染野毒，必须对每群动物投放一定比例的“哨兵”动物，这在实际操作中不具有可行性，只能针对风险性最高的动物群实施，因此，难以大范围应用。

3.只能在群体水平进行鉴别。使用“哨兵”动物只能在群体水平鉴别动物群是否感染野毒，不能了解和掌握动物群感染的比例和状态。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种鉴别免疫动物，如禽、猪等是否感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验。通过检测A型流感病毒NA蛋白血清抗体进行判断，该方法操作简单，结果判定直观，特异性好。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种检测A型流感病毒NA蛋白血清抗体的间接免疫荧光试验方法，包括如下步骤：

(1)采集接种了A型流感“标记”疫苗的动物，如禽、猪等血液，分离血清，并用PBS溶液稀释；

(2)表达NA基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，并表达NA蛋白；

(3)将步骤(1)中稀释的禽血清加入到步骤(2)中表达NA蛋白的昆虫细胞上，室温作用一段时间；

(4)用PBS溶液漂洗，然后加入适量FITC标记的兔抗鸡二抗，室温作用一段时间；

(5)用PBS溶液漂洗，然后加入适量碳酸甘油缓冲液，在荧光显微镜下观察是否有荧光出现；

(6)根据观察的结果判断动物，如禽、猪等是否感染相应亚型流感病毒。

进一步，如上所述的鉴别免疫动物感染A型流感病毒的抗体间接免疫荧光试验方法，在步骤(2)中获得接种了表达NA基因的重组杆状病毒，具体方法如下：

①使用RT-PCR技术扩增A型流感病毒NA基因；

②把NA基因克隆到昆虫杆状病毒表达载体(pFast-Bac)中，获得表达NA基因的重组杆状病毒；

③把重组杆状病毒接种到昆虫细胞上表达NA蛋白，一段时间后，去掉细胞培养上清液，用丙酮固定细胞，直接作为抗原检测NA血清抗体。