[发明专利]鱼腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工艺

说明书

技术领域

本发明属于生物酶分离与提纯工程技术领域，尤其是涉及在鱼腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜等植物中提取高纯度超氧化物歧化酶(SOD)的技术。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)作为生物体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，避免生物体内超氧阴离子自由基浓度过高引起的不良反应。在防辐射、糖尿病、肺病、肝炎、心血管病、肿瘤、红斑狼疮、白内障、类风湿、关节炎症、变质性炎症、渗出性炎症、增生性炎症、特异性炎以及自身免疫治疗等方面具有独特的功效。同时，超氧化物歧化酶可以作为美容化妆品、保健食品饮品的活性成分。

目前用于动物或者植物SOD的提取工艺，大多都采用分步盐析和有机溶剂沉淀等传统的分离纯化技术。这些传统的分离纯化技术在工业应用上都存在一定的局限性，如分步盐析和有机溶剂沉淀容易引起蛋白质的变性和失活等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以在鱼腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜等植物适于工业应用的高纯度超氧化物歧化酶提出工艺，解决现有存在的缺陷。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

鱼腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工艺，包括如下步骤：

A)对原料进行预处理，将所述的植物原料经过循环超声提取破碎后，经匀浆机匀浆后，8000～10000rpm高速离心6～30min，过滤制得粗提液；

B)将步骤A)所得的粗提液依次通过PEG、GST、Ni亲和层析柱纯化目的蛋白；

C)将步骤B)所得的粗提液pH值通过100～500mM的Tris和100～500mM的PBS缓冲液调整为7～8；

D)对步骤C)所得的洗脱液依次用截留分子量为30～50kDa和截留分子量为70～150kDa的超滤膜进行超滤，制备高纯度的超氧化物歧化酶；

E)对超滤液进行进一步浓缩，制得SOD浓缩液；对SOD浓缩液进行冷冻干燥，制备得冻干粉，备用。

优选的方案是：还包括对超滤液浓缩得到的小分子物质中的活性物质进一步重组利用的步骤F)；所述活性物质包括RNA、维生素、安基酸、短肽等。

更优的方案是：还包括对植物原料经破碎机破碎后过滤的滤渣进行加工处理的步骤G)，所述步骤G)为

G1)对渣加入保护液进一步提取，等浓缩后，喷雾干燥，制备果糖或者果胶；

和/或者

G2)对渣加入保护液并同时添加烯醇液进一步分离黄酮后，对分离分离液通过层析柱层析精制，并对层析洗脱液进一步浓缩，制得其它活性物质；所述其它活性物质包括RNA、维生素、安基酸、短肽等。

通过本发明所述的高纯度超氧化物歧化酶提出工艺，通过循环超声提取破碎，GST及Ni分步亲和层析以及超滤几个步骤便能从鱼腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜等植物中分离纯化到高纯度超氧化物歧化酶，分离纯化到的高纯度超氧化物歧化酶纯度可以高达98％，酶活力可以高达5～6×10⁶U/g。本发明所述的提出工艺，更是可以对超滤液浓缩得到的小分子物质中的活性物质进一步重组利用；并对植物原料经破碎机破碎后过滤的滤渣进行加工处理，制得果糖以及其它活性物质，使原材料的价值得到充分的利用。本发明所述的高纯度超氧化物歧化酶提出工艺填补了国内天然多元抗氧化活性物的空白，为人类的健康及再次改良高经济作物具有超前创新重大意义，将会使食品和保健品行业得到革命性的调整。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1鱼腥草高纯度SOD的提取

A)取清洁的鱼腥草经过循环超声机充分破碎，经匀浆机匀浆约1min，8000～10000rpm高速离心6～30min，过滤制得粗提液；

B)将步骤A)所得的粗提液依次通过PEG、GST、Ni亲和层析柱纯化目的蛋白；

C)将步骤B)所得的粗提液pH值通过100～500mM的Tris和100～500mM的PBS缓冲液调整为7～8；

D)对步骤C)所得的洗脱液依次用截留分子量为30～50kDa和截留分子量为70～150kDa的超滤膜进行超滤，制备高纯度的超氧化物歧化酶，测定纯度及酶活力，测定结果纯度高达98.2％，酶活力可以高达5.3×10⁶U/g；

E)对超滤液进行进一步浓缩，制得SOD浓缩液；对SOD浓缩液进行冷冻干燥6～8h，制备得冻干粉，备用。

F)对超滤液浓缩得到的小分子物质中的活性物质进一步重组利用。