[发明专利]一种革兰氏阳性菌DNA疫苗及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种革兰氏阳性菌DNA疫苗及其构建和应用。

背景技术

海豚链球菌(Streptococcus iniae)是一种革兰氏阳性菌，能够感染人、动物和多种鱼类，包括罗非鱼、真鲷、牙鲆、鲈鱼、虹鳟、大菱鲆、条石斑等。海豚链球菌已被公认为一种重要的水产养殖病原菌，每年给我国以及世界养殖业造成巨大的经济损失。目前，商业化海豚链球菌疫苗只有简单的灭活疫苗，这种疫苗在以色列的使用已证明其具有各种缺点，包括保护效应短并具有区域性等。不同于简单的灭活疫苗，DNA疫苗是一种分子疫苗，其构建原理是用将疫苗抗原基因克隆于真核表达载体，随后将携带疫苗抗原的表达载体导入所要免疫的动物；随着疫苗载体进入宿主动物细胞，疫苗抗原在机体细胞内表达、合成并刺激机体的免疫系统，从而诱发一系列保护性免疫应答。研究表明，灭活疫苗主要诱发以抗体为主的体液免疫，而DNA疫苗则既能诱发体液免疫也能诱发细胞免疫，并且其免疫效应可以很长。另外，DNA疫苗具有稳定、应用简单、可以长期储存等优点，因而是一种具有良好应用和发展前景的疫苗形式。目前在水产养殖中，针对细菌的DNA疫苗很少。

发明内容

本发明目的在于提供一种革兰氏阳性菌DNA疫苗及其构建和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种革兰氏阳性菌DNA疫苗：疫苗序列表由SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

构建：以海豚链球菌G26为模板，用引物F4和R2进行PCR扩增，扩增产物与载体pBS-T连接，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α而后在含有100ug/ml安卡青霉素(Ap)、40ug/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-乳糖苷(Xgal)和24ug/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养，挑出白色转化子，提取质粒；所得质粒用SmaI酶切，回收0.5kb片段，同时将质粒pCN3用SmaI酶切回收5.5kb片段，将上述回收的两片段用T4DNA连接酶于室温连接2-4小时，连接液转化到大肠杆菌DH5α后在含有Ap(100ug/ml)的LB固体培养基上培养24小时，挑取转化子，提取质粒，即为含有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列的DNA疫苗质粒pCNS10；所述引物F4为5’-CCCGGGCCACCATGGCAGAATTTAATCAATCAAA-3’；R2为5’-CTCGAGCCCGGGGATATGAATATAATTATATGAGCT-3’。

应用：所述DNA疫苗对海豚链球菌具有免疫保护作用。所述DNA疫苗使牙鲆对海豚链球菌具有免疫保护作用。所述将DNA疫苗质粒溶于PBS至浓度为200ug/ml，DNA疫苗悬液以100-120ul的剂量对鱼类进行肌肉注射。

本发明具有如下优点：

1.高保护率。本发明的疫苗对海豚链球菌的免疫保护效率达86％以上。

2.长效。本发明的疫苗在免疫后两个月的保护效率仍然可达86.7％。

3.安全。本发明的疫苗没有任何细胞毒性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrookand Russell：Molecular Cloning：A Laboratory Mannual.Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。

实施例1

DNA疫苗由序列表SEQ ID No.1中的碱基序列所示。

序列表1

ATGAAAAAAATCGCAACTATTACTACATTAACAGCAGGCATTGGCGCTGCATATTTCGGTACAACTGCTCATCACGCAGA

TGCTGCAGAATTTAATCAATCAAATAATCAATCATATAATTATAATACAGCTCAAACATCTACTAGCAATACTACATCAG

AAAGATCTGCTTCTGGTAACTTATATACAGCTGGTCAATGTACTTGGTACGTTTATGACAAAGTTGGCGGAAAAGTAGGC