[发明专利]液-固萃取体系分离纯化血清白蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用液-固萃取体系从血液中分离纯化血清白蛋白的方法，更具体地说是涉及用液-固萃取体系从人血浆或牛血浆中纯化血清白蛋白的方法。更具体地说，是通过分子识别机理，用聚乙二醇(PEG)二元脂肪酸修饰物混合聚合物-盐-水液-固亲和萃取法从血液中提取血清白蛋白。

背景技术

血清白蛋白是一种水溶性很强的蛋白，结构稳定，能结合多种小分子，在医学临床及生物领域有着广泛的应用。蛋白质的分离纯化原理主要基于溶解度差异、电荷差异、分子大小、疏水作用、生物亲和差异来达到分离的。作为生物分子，蛋白质的分离纯化与其它化学产品的分离有很大的差异：通常完成一次产品的纯化需要好几种方法结合使用，一般分为：前处理、粗分离、细分离和结晶四个步骤。随着人类对蛋白质认识的深入，分离纯化方法也一直在改进，当今纯化研究的重点在提高纯度、回收率，降低成本、减少繁冗的操作时间和步骤。

目前，血清白蛋白的分离纯化方法有很多种，各自都具有一定的特点，归纳起来主要有以下方法：

1、利用溶解度差异分离纯化血清白蛋白

沉淀法是一种初级分离技术，但是，多步操作也可以获得高纯度的目标产品。

(1)盐沉淀法

蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中溶解度有不同程度的降低，采用添加中性盐的方法使各种蛋白质依次分别沉淀出来的方法，叫盐析法，比如硫酸铵、利凡诺、辛酸盐沉淀法。但是盐析法可能产生蛋白质聚合体或蛋白质变性，影响药用效果，自动化程度低、生产周期长、成本高、纯化倍数低。因此，在目前的实际应用中受到一定的限制。

(2)有机溶剂沉淀法

向蛋白质溶液中加入乙醇等水溶性溶剂之后，水的活度降低，利用有机溶剂较低的介电常数来沉淀白蛋白。最常用的是冷乙醇沉淀法，即著名的Cohn法。虽然广泛应用于工业生产，但乙醇沉淀法也有一些不足：乙醇是一种非特异性沉淀剂，尽管对人血清白蛋白HSA生产效果显著，但产品纯度不是很高；作为有机溶剂的乙醇还可能使蛋白质发生聚集变性或者二级构象改变；生产不易实现自动化，生产周期长；在非封闭式的环境中有机溶剂对工作人员危害也较大，同时也有可能由于环境不洁造成产品污染。

(3)聚乙二醇(PEG)沉淀法

PEG沉淀的条件温和，可以避免蛋白质聚集或变性，而且沉淀完全，但大量PEG价格较贵，从白蛋白溶液中除去在工业生产上需较大成本。M.I.Jimenez等人将聚乙二醇和乙醇结合来纯化血清白蛋白，分离迅速，并达到了实验室中等分离规模。但又用到了有机溶剂乙醇。

2、利用电荷差异分离纯化血清白蛋白

(1)离子交换色谱

这是迄今利用较广泛的色谱技术，在纯化中占了75％。因为它具有分辨率高，交换容量大以及明确的作用机理等特点。在白蛋白的分离纯化上有很重要的作用。但色谱柱的再生、保存、使用步骤烦琐，以及容易出现柱阻塞等问题，限制了它的进一步使用。

(2)电泳法

电泳分离的原理和操作形式多样，经过几十年的发展，成为分离纯化，特别是鉴定蛋白质的有力工具，现在正向综合方向发展。尹开吉等利用压力驱动的毛细管等电聚焦分离牛血清白蛋白和血红蛋白，得到了理想的分离结果，且操作简单。K.A.Denton等用中性涂布的高效毛细管分离临床用HSA，得到了八种组分峰。但是电泳法分离纯化蛋白质的量很少，不属制备范畴，无法满足制备需求，且电泳过程中产生的热量可能导致蛋白质变性，并且成本也很高。

3、利用分子大小差异

(1)凝胶层析法

这是20世纪60年代初发展起来的一种简单有效的技术。利用凝胶分子筛对大小、形状不同的蛋白进行分离。分子大小相差25％的样品，通过单一的凝胶就可以完全分开。应用于提纯蛋白质、激素、核酸等。同时还可以进行脱盐、浓缩、脱色、去热原。具有分离效果好、操作简单方便、分离广泛及不影响生物活性的特点。但是分辨率不高，分离操作较慢，对于质量差异不大的样品难以达到很好的分离。此外，凝胶层析要求样品黏度不宜太高。凝胶颗粒有时还有非特异性的吸附现象。

(2)离心法

离心法具有可以迅速将沉淀和上清液分开、应用范围广，成本低等特点，但无法获得纯度很高的产品。并且受样品浓度影响，离心力过大常会导致样品颗粒变性、聚集而失活。

4、利用特殊选择性分离纯化血清白蛋白

杨利等用IDA型固定化镍离子金属螯合亲和膜色谱对HSA分离纯化，产品经毛细管电泳分析，纯度与Sigma公司的电泳纯HSA相当，回收率可达85％以上。