[发明专利]一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶及其应用

权利要求书

1.一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶，其特征在于它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种权利要求1所示耐高温L-阿拉伯糖异构酶的编码基因，其特征在于它具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.一种产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌，其特征在于它包含如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列。

4.权利要求3所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)构建含有耐高温L-阿拉伯糖异构酶基因的表达质粒：

取发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1CGMCC NO.2921基因组DNA作为模版，以包含EcoRI和XhoI的酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增：

引物1：5’-AGAGAATTCATGCGTAAGATGCAAGATTAC-3’

引物2：5’-AAGCTCGAGCTACTTGATGTTGATAAAGT-3’

PCR扩增体系为：基因组DNA2μL，引物1和引物2各1μL，dNTP2μL，10×Tag缓冲液2.5μL，ExTag聚合酶0.5μL，ddH₂O 14μL；

PCR反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性2min；然后60℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸1min；

回收PCR扩增产物，经限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-araA；

(2)将该重组质粒pET-araA转化至宿主细胞中：

将重组质粒pET-araA转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养18～24h得到初步阳性克隆；

(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆：

分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和XhoI酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO：1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-araA，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。

5.一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶的表达方法，其特征在于将包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因工程菌接种于添加了25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以5％(v/v)的接种量转接到含25μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃发酵培养2～3小时，至OD₆₀₀为0.6时加入0.2～1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或0.5～2g/L的乳糖，继续诱导表达6～12小时后，离心收集菌体。

6.权利要求1所述的耐高温L-阿拉伯糖异构酶在制备D-塔格糖中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于以1～100g/L的D-半乳糖为底物，加入耐高温L-阿拉伯糖异构酶进行酶转化反应，耐高温L-阿拉伯糖异构酶的用量为10～500mg/L，反应温度40～70℃，转化时间8～15h。

8.权利要求3所述的产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌在制备D-塔格糖中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于以1～100g/L的D-半乳糖为底物，加入经诱导表达后的产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌进行转化反应，产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的用量以湿菌体计为10～100g/L，反应温度40～70℃，转化时间12～48h。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于以1～100g/L的D-半乳糖为底物，添加0.5～2mmol/L Mn²⁺离子和1～3mmol/L Co²⁺离子，加入经诱导表达后的产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌进行转化反应，产耐高温L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的用量以湿菌体计为10～100g/L，反应温度40～70℃，转化时间12～48h。