[发明专利]一种长效胰高血糖素样肽-2及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种由人血清白蛋白和胰高血糖素样肽-2组成的融合蛋白及其制备与应用。

技术背景

胰高血糖素样肽-2(GLP-2)是由33个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量约为3.9KD。与胰高血糖素之间存在约50％的氨基酸序列同源性。GLP-2存在3种形式，即有活性的GLP-2^1～33、无活性的GLP-2^3～33和未处理的主要胰高血糖素原片段(MPGF)。其在循环血液和组织中以完整的有活性的GLP-2^1～33形式为主，但GLP-2^1～33可被二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidase IV，DPP IV)从氨基端第2位的丙氨酸(Ala₂)残基处切除掉2个氨基酸残基而产生31个氨基酸残基组成的无活性的GLP-2^3～33。GLP-2目前已成为一种倍受推崇的肠道保护激素，被广泛应用于各种原因引起的肠道损伤修复及代偿的研究中。它在肿瘤放化疗、严重创(烧)伤、全肠外营养、炎症性肠病等因素引起的肠粘膜损伤、失血性休克、广泛肠切除、小肠移植等方面均具有潜在的临床应用价值。目前，美国NPS制药公司开发的可以抵抗DPP IV降解作用的GLP-2的突变体h[Gly2]GLP-2(商品名为teduglutide)已进入用于短肠综合征(SBS)和Corhn’s肠炎治疗的临床研究。然而在血液循环中，GLP-2^1～33和GLP-2^3～33的生物半衰期都较短，在人体分别约为7min和27min，使得在治疗过程中频繁给药才能获得良好的疗效，并且其治疗周期往往较长，因此研制出作用时间长的重组胰高血糖素样肽-2具有重要意义。

人血清白蛋白(Human serum albmin，HSA)是含585个氨基酸的非糖基化单链结构分子(A.Dugaiczyk et al.，PNAS，198279：71-75)，是人体血清中的主要成分，广泛分布于血管内外，主要由人体肝脏产生，其对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用，肾清除率非常低，体内半衰期长，为14～20d。而且它没有酶或免疫活性，是体内因子和药物转运的天然载体，因此可望作为提高小分子蛋白在血液中的半衰期的载体。相关研究成果表明，很多蛋白药物与人血清白蛋白融合表达后，与先前的蛋白药物相比，药效相似，但体内半衰期大大延长。胰高血糖素样肽-2在预防和治疗化疗中导致肠胃损伤、短肠综合症SBS、Corhn’s肠炎等疾病过程中，医疗周期往往很长，长周期的频繁用药会增加病人的痛苦和毒副作用。且本发明融合蛋白在酵母菌中表达与现有胰高血糖素样肽-2相比，具有生产成本低、效率高、易于纯化等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种集胰高血糖素样肽-2和血清白蛋白的特性为一体的胰高血糖素样肽-2-人血清白蛋白融合蛋白及编码基因。与现有胰高血糖素样肽-2相比，本发明的融合蛋白具有以下优点：1)能够在酵母菌中实现胞外表达，产量高，无需复性，易纯化。2)重组融合蛋白在体内的半衰期延长，且作用效果明显，能减少现有胰高血糖素样肽-2潜在的毒副作用，发挥最大的治疗作用。3)重组表达生产成本较低、效率高，利于工业大量生产。

本发明所提供的长效融合蛋白名称为h[Gly2]GLP-2-HSA融合蛋白，以下简称GLH融合蛋白。

本发明的GLH融合蛋白，包括与序列表中SEQ ID No：2胰高血糖素样肽-2氨基酸序列相同的第二区和与序列表中SEQ ID No：1人血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区。在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的蛋白，但这些改变不能明显改变蛋白质的一个或多个有用的配体结合和生物活性的能力。特别是，将人血清白蛋白和人血清白蛋白片段中天然发生的多态性变体包括在内，融合蛋白中白蛋白可来自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，如：牛、羊、猪、鸡或鲑鱼。此外，胰高血糖素样肽-2可以由生物体中提取，也可以通过生物技术工程的方法获得。

可以通过对本发明的GLH融合蛋白中个别氨基酸残基进行取代、缺失或插入，得到与正常胰高血糖素样肽-2或血清白蛋白具有至少85％的序列同源性的变体。相对于正常的血清白蛋白，血清白蛋白变体应至少包含或是有血清白蛋白的一个完整的结构域组成。相对于正常的胰高血糖素样肽-2，胰高血糖素样肽-2的突变体具有与胰高血糖素样肽-2相同的活性，包含本领域内所周知的胰高血糖素样肽-2所有突变体。