[发明专利]一种长效镇痛肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种由人血清白蛋白和虎纹镇痛肽组成的融合蛋白及其制备与应用。

技术背景

人血清白蛋白(Human serum albmin，HSA)是含585个氨基酸的非糖基化单链结构分子(A.Dugaiczyk et al，PNAS，198279：71-75)，是人体血清中的主要成分，广泛分布于血管内外，主要由人体肝脏产生，其对维持体内渗透压和血浆体积起着至关重要的作用，肾清除率非常低，体内半衰期长，为14～20d。并且它没有酶或免疫活性，是体内因子和药物转运的天然载体，因此可望作为提高小分子蛋白在血液中的半衰期的载体。相关研究成果表明，很多蛋白药物与人血清白蛋白融合表达后，与先前的蛋白药物相比，药效相似，但体内半衰期大大延长。

虎纹镇痛肽(HWTX-I)最初是从虎纹捕鸟蛛中提取的一种N-型Ca²⁺通道阻断剂，其分子量为3750Da，由33个氨基酸残基组成，二维核磁共振方法解析HWTX-I的空间结构为以三对二硫键和三股反平行的β-折叠为核心的结构模体(梁宋平，生命化学，1997 17：21-23)。HWTX-I硬膜外给药显示良好的镇痛效果，且没有成瘾性，经实验无致突变作用，不会引起过敏反应，没有肌肉震颤副作用。其在解除晚期癌症病人的痛苦方面显示了潜在的应用和开发价值，作为新型镇痛剂具有巨大的开发利用前景。但现在进入三期临床的HWTX-I在体内从血液中清除的速度快，半衰期较短，而在HWTX-I治疗疼痛特别是慢性疼痛的疾病时，治疗的周期往往很长，这种长期大量频繁的用药，不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且增加了毒副作用。研究结果表明与人血清白蛋白融合形成的融合镇痛肽其半衰期显著延长，增强了治疗效果。并且融合镇痛肽在酵母中表达与现有的HWTX-I表达相比，具有生产成本较低、效率高、易于分离纯化等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种集血清白蛋白和虎纹镇痛肽的特性为一体的白蛋白-虎纹镇痛肽融合蛋白及其编码基因，解决虎纹镇痛肽在治疗上存在的不足。与现有的虎纹镇痛肽相比，本发明的重组融合蛋白具有以下优点：1)能够在酵母菌中实现胞外高表达，产量高，无需复性，易纯化。2)重组融合蛋白在体内的半衰期延长，且镇痛作用效果强，能减少现有虎纹镇痛肽潜在的毒副作用，发挥最大的治疗作用。3)重组表达生产成本较低、效率高。

本发明的长效镇痛肽融合蛋白，包括与序列表中SEQ ID No：1血清白蛋白氨基酸序列相同的第一区，连接在血清白蛋白C-末端的与序列表中SEQ ID No：2虎纹镇痛肽氨基酸序列相同的第二区，和连接在血清白蛋白N-末端的与序列表中SEQ IDNo：2虎纹镇痛肽氨基酸序列相同的第二区，所述的融合蛋白可以由上述的第一区和第二区连接构成。

在不改变所述长效镇痛肽融合蛋白特性前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的蛋白，但这些改变不能明显改变蛋白质的一个或多个有用的配体结合和镇痛活性的能力。特别是，将人血清白蛋白和人血清白蛋白片段中天然发生的多态性变体包括在内，长效镇痛肽融合蛋白中的白蛋白可来自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，如：牛、羊、猪、鸡或鲑鱼。此外，虎纹镇痛肽可以由虎纹捕鸟蛛的毒素中提取，也可以通过生物技术和化学合成的方法获得。

可以通过对本发明的长效镇痛肽融合蛋白中个别氨基酸残基进行取代、缺失或插入，得到与正常血清白蛋白或虎纹镇痛肽具有至少85％的序列同源性的变体。相对于正常的血清白蛋白，血清白蛋白变体应至少包含或是有血清白蛋白的一个完整的结构域组成，如结构域1(1-194)，2(195-387)，3(388-585)，或者是三个结构域的不同组合。此外，每个结构域本身由两个不同源亚结构域组成，这些亚结构域范围为1-105，120-194，195-291，316-387，388-492，512-585。优选长效镇痛肽融合蛋白的血清白蛋白部分至少包含一个血清白蛋白的亚结构域，或结构域。相对于正常的虎纹镇痛肽，虎纹镇痛肽突变体具有镇痛活性，包含本领域内所周知的虎纹镇痛肽所有突变体。

当用本领域公认的软件与其他任何具有类似的DNA序列对比分析时，某一特定的序列如与本发明所提出的序列有85％以上的序列同源性，均认为与本发明长效镇痛肽融合蛋白所述的序列相同源。