[发明专利]用于卷烟烟气细胞毒性检测的中性红溶液的配制方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种用于卷烟烟气细胞毒性检测的中性红溶液的配制方法，属于卷烟烟气安全性评价技术领域。

背景技术：

国家烟草专卖局于2002年11月正式向全国烟草行业提出“中式卷烟”，成为中国烟草发展的方向、卷烟技术革命的重心。中式卷烟遵循三项原则是：高香气、低焦油、低危害。卷烟和烟用添加剂的安全性评价能够为中式卷烟型烤烟的研发和不断提升提供正确的指导和有力的支撑，有利于烟草行业的可持续发展。

细胞毒性检测是卷烟和烟用添加剂安全性评价体系中的重要评价技术方法。中性红细胞毒性法是国际推行和应用广泛的细胞毒性检测方法，该方法具有检测稳定、重复性好、剂量-反应关系显著、批量检测等优点，完全适用于卷烟和烟用添加剂的安全性评价。

中性红是一种弱阳离子染料，能够穿过细胞膜并聚集在胞内的溶酶体内。外源性物质作用下，细胞表面或者溶酶体膜改变会导致溶酶体活性降低或者产生其他变化，这些变化都是不可逆的。一定条件下，从细胞内萃取的中性红的数量和活细胞数量呈线形关系。进行中性红细胞毒性检测时，中性红溶液采用细胞培养液进行配制，根据选用的细胞株和其他检测条件的不同，所用的细胞培养液和中性红溶液的浓度不同。

中性红是结晶性粉末，使用同一种细胞培养液配制相同浓度的中性红溶液时，因配制过程中操作方法不同，中性红的溶解程度不同，造成试验结果之间的误差较大。例如，实验室常用的溶液加热方式有微波炉加热、电磁炉加热以及水浴锅加热等多种方式，由于中性红溶液采用细胞培养液进行配制，需要最大限度地维持细胞培养液的营养成分，因此加热方式的选择很关键。配制中性红溶液通常先配制母液，再将其稀释至工作浓度。中性红溶液在稀释时容易产生中性红析出现象；稀释后的中性红溶液与细胞孵育后，容易在细胞培养板或者细胞培养瓶内留下针状结晶，影响了试验检测的准确性和重复性。

目前，关于中性红细胞毒性法用于卷烟烟气安全性评价的研究已有报道。但经文献搜索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。

附参考文献：

[1]王琴美，蓝勤娴，吴嘉彤等，2007.部分国产烤烟型卷烟烟气冷凝物的中性红细胞毒性试验.烟草科技，5：41-43.

[2]Ciapetti G，Granchi D.，Verri E.et al.，1996.Application of a combination ofneutral red and amido black staining for rapid，reliable cytotoxicity testing ofbiomaterials.Biomaterials.17：1259-1264.

[3]Fotakisa G.and Timbrell J.A.，2006.In vitro cytotoxicity assays：Comparisonof LDH，neutral red，MTT and protein assay in hepatoma cell lines followingexposure to cadmium chloride.Toxicology Letters，160：171-177.

[4]Health Canada Offical Method T-502，second edition，2004.Neutral reduptake assay for mainstream tobacco smoke.

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种更加准确、可控的用于卷烟烟气细胞毒性检测的中性红溶液的配制方法。

本发明的用于卷烟烟气细胞毒性检测的中性红溶液的配制方法在现有技术的基础改进得到，改进如下：

a.细胞培养液的pH值为6.8-7.0，细胞培养液采用37℃恒温水浴方式预热30-60分钟；

b.用预热后的细胞培养液配制中性红溶液母液1％(w/v)时，采用在磁力搅拌器上搅拌溶解15-20分钟；用预热后的细胞培养液采用相同方法将中性红溶液稀释至工作浓度50μg/mL；

c.用常温低速离心机对配制和稀释后的中性红溶液离心800-1000g处理3-5分钟，除去未溶解成分；再用0.22μm的滤膜过滤。

本发明方法得到的中性红溶液用于中性红细胞毒性检测中，具有检测准确性高、重复性好、可控性强的优点。并为卷烟和烟用添加剂安全性评价中细胞毒性检测的准确性和重复性提供技术支持。

具体实施方式：

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。