[发明专利]一种用于基因治疗及疫苗研制的人工合成启动子

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于基因治疗及疫苗研制的人工合成启动子。 

背景技术

基因治疗就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，达到疾病治疗的目的。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。在基因治疗领先的美国，到1995年经美国食品和药品管理局(FDA)批准进入临床试验的基因治疗方案有100余个，实际上，在一些重大关键技术问题未获解决前，不能期待基因治疗在旦夕之间会有重大突破。事实上100多个已批准的方案中，有肯定疗效者寥寥无几。目前全世界只有四种病例是初见成效的，它们分别是：联合免疫缺陷症(ADA)，血友病B，家族性高胆固醇血症和遗传性肺气肿。这与需要治疗的几千种病例相比简直太少了，因而专家们提出，当前的基因治疗应该回到基础研究上。 

目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。主要表现为：(1)基因导入系统缺乏靶向性，同时效率也较低。(2)导入基因现有的表达量还太低，如血友病B的基因治疗，凝血因子9的表达量只有正常人的5％，若能达到10％，则治疗效果会大大提高。事实上，自1995年以来，全世界基因治疗领域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于基因治疗及疫苗研制的人工合成启动子。 

所述的用于基因治疗及疫苗研制的人工合成启动子的制备，包括以下步骤： 

1.合成特异启动子SEP序列 

合成两段互补的序列，分别为SEQ No 1和SEQ No 2，具体如下： 

SEP-F：GCTAGC

GTAGATATATAAGGGACTACGGCCGCTTGCGACGTCATTCGCGAT 

GGAACGCTCGAGCTGAGCAGACCTGGCTACAGACCA GCTAGC

SEP-R：CGATCG

CATCTATATATTCCCTGATGCCGGCGAACGCTGCAGTAAGCGCTAC 

CTTGCGAGCTCGACTCGTCTGGACCGATGTCTGGT CGATCG

两段序列的5′和3′端都加酶切位点Nhe I。 

2.合成增强启动子ESP序列 

将上述经人工合成的特异性启动子SEP序列，通过酶切连接将其插入到含有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1载体内，即得到一新的增强性启动子ESP序列，并经上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定，测定其序列为SEQ No 3。 

3.质粒抽提 

通过测序将插入序列正确的增强启动子ESP克隆命名为pEGFP-ESP-C1，并用小量质粒回收试剂盒进行质粒抽提，-20℃冻存备用。 

4.细胞转染试验 

借助转染试剂Lipofectamine^TM 2000将上述合成的增强启动子ESP和pEGFP-C1质粒转入BHK21细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。 

5.绿色荧光蛋白GFP基因检测 

将上述转染24h的细胞取出，弃掉上清液，用PBS洗三次，加入100uL细胞裂解液裂解细胞。取出75uL用Modulus^TM单管型多功能检测仪检测GFP荧光值。 

上述试验结果显示：含有启动子ESP序列的pEGFP-ESP-C1荧光蛋白表达量明显高于只有CMV启动子的pEGFP-C1，而且表达稳定，说明本发明的人工合成启动子可用于基因治疗载体和真核表达载体的构建，将导入的基因在细胞内的表达水平提高，为基因治疗的最后成功打下基础也为新型疫苗研制做好铺垫。 

附图说明

图1为质粒pEGFP-C1转染细胞荧光显微镜结果。 

图2为质粒pEGFP-ESP-C1转染细胞荧光显微镜结果。 

图3为绿色荧光蛋白GFP基因检测结果。 

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。 

材料来源 

1.宿主菌、细胞和质粒DNA 

大肠埃希氏菌(E.coli)种TOP10、BHK21细胞和含有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1质粒，均由上海市农业科学院畜牧所病毒课题组提供。