[发明专利]一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因及其抗低温应用

说明书

技术领域

本发明属分子生物学与基因工程领域，具体涉及一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因克隆及其应用。

背景技术

干旱、盐渍和低温都能引起植物水分亏缺，在这期间植物细胞积累一系列的蛋白质来保护细胞免受脱水伤害。环境胁迫除了引起代谢变化和低分子量保护性化合物的积累外，植物的许多基因可被激活转录，并导致植物营养组织中新蛋白的积累，特别是植物干旱、低温诱导蛋白的研究已受到普遍关注，其中胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundantprotein，LEA)是指胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质，其具有亲水性和热稳定性，广泛存在于高等植物中，且受发育阶段、脱落酸(ABA)和脱水信号的调节，因此成为当前在逆境研究方面的一个重要课题。

LEA蛋白是一类亲水性大家族，共同特点是由极性氨基酸组成，为亲水性的多肽，甘氨酸含量＞6％，亲水指数＞1.0，大多数LEA蛋白缺乏半胱氨酸和酪氨酸残基。根据LEA蛋白氨基酸序列同源性和特定的序列单元，LEA蛋白被分为6组。由于各组LEA蛋白序列和可能的蛋白质结构不同，每一组LEA蛋白在水分胁迫下有不同的功能。

LEA蛋白表达受发育阶段控制，但它们也能在施加外源ABA的离体胚中表达，许多营养组织在外源ABA、渗透和低温胁迫的诱导下能产生特异的LEA mRNA和LEA蛋白。LEA蛋白表达无组织特异性，可以在转录水平上被ABA、高渗透浓度和水分胁迫所诱导。植物在受到干旱胁迫时，LEA基因的高水平表达和LEA蛋白的大量积累，表明LEA具有干旱保护功能。种子在自然成熟过程中发生自燃的干化作用，LEA蛋白的作用是保护种子细胞免受由干化引起的伤害，并且在部分种类耐受寒冷冻的生理作用中具有重要意义。

LEA蛋白最显著的物理化学特性是具有很高的亲水性和热稳定性，即使在煮沸条件下也能保持水溶状态，同时可能形成一种离子载体为那些即将干化失水的组织细胞中的离子凝结/结晶作好准备。在干旱脱水过程中细胞液的离子浓度会迅速升高，高强度的离子浓度会造成细胞的不可逆伤害。第3组LEA蛋白中的11个氨基酸残基组成的基元序列可形成兼性a2螺旋结构，提供一个具疏水条区的亲水表面，螺旋的疏水面可形成同型二聚体，处在亲水表面的带电基团可鳌合细胞脱水过程中浓缩的离子，如Na⁺和PO³⁺。此外，组成该蛋白的大多数氨基酸残基为碱性、亲水性氨基酸，无半胱氨酸和色氨酸，这些高电荷的氨基酸残基可以重新定向细胞内的水分子，束缚盐离子，从而避免干旱胁迫时细胞内高浓度离子的累积所引起的损伤，同时也可防止组织过度脱水。目前，在多种植物中都有关于第3组LEA蛋白或基因的研究报道，这些基因的表达或蛋白累积与植物的渗透胁迫抗性呈正相关。萌芽3天的大麦幼苗经ABA或干旱处理后，幼苗的所有器官中均有高水平的HVA1 mRNA和蛋白质出现，它可被干旱等环境胁迫和ABA诱导表达。Xu等将HVA1 cDNA全序列导入水稻，获得了抗旱、抗盐的转基因水稻，从而直接证实了第3组LEA基因可能具有干旱保护功能。

LEA广泛存在于高等植物种子中，首先是在棉花中被发现，后来相继在大麦、胡萝卜、小麦、大豆、番茄和向日葵植物中检测到此类蛋白。

在众多的研究中，并没有看到在多抗植物腊梅中有关LEA的相关报道，而腊梅【Chimonanthus praecox】作为一种具有多抗特性的物种，对外界环境的适应能力比较强，并且腊梅耐旱、耐寒、病虫害较少，在腊梅中一定存在多抗基因。发明人利用本实验室构建的腊梅花ESTs序列，从腊梅花cDNA文库中克隆了胚胎发育晚期丰富蛋白基因(CpLEA3)。构建了腊梅LEA基因的表达载体，使表达菌株表达该基因的编码蛋白，通过低温胁迫后测菌落生物活性以及细胞膜通透性损伤情况，发现CpLEA3基因能提高菌株的抗低温能力，因而本发明具有创新性。

发明内容

(1)提供一种DNA序列，其编码一种腊梅胚胎发育晚期丰富蛋白的基因，命名为CpLEA3；(2)提供一种利用基因工程方法得到CpLEA3编码的蛋白；(3)提供CpLEA3在菌株抗低温基因工程方面的应用。

本发明提供了CpLEA3基因，它具有如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。