[发明专利]沉默细胞因子信号抑制因子1并表达高迁移率族蛋白B1以及肿瘤相关抗原的质粒及其制备方法

说明书

技术背景

细胞因子信号抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)是新发现的一个抗原呈递的抑制因子，已证实其在维持自身耐受性和限制抗肿瘤免疫方面起着关键性的作用。SOCS1是T细胞和抗原呈递细胞中多种致炎细胞因子的信号传导的关键负性调节蛋白，这些细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15等。作为一种反馈机制，SOCS1在促炎症反应刺激之后诱导表达，可作为一种假底物阻止JAK和STAT结合，同时可增加JAK的泛素化降解，此外，SOCS1还可以通过抑制NF-κB信号通路来负调控Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)信号。

最新的研究证实，沉默SOCS1能够增强树突状细胞(dendritic cells，DCs)的免疫刺激能力和持续时间，从而克服宿主水平的自身耐受，高度活化抗原特异性的CTL反应。体内实验已证实该方法可以有效抑制小鼠体内建立的低免疫原性的肿瘤的生长。更引人注意的是，还有证据显示沉默这类抗原呈递弱化因子有可能克服调节性T细胞(regulatory Tcells，Treg)介导的免疫耐受。Treg可以抑制CD8+T细胞、CD4+CD25-T细胞以及自然杀伤细胞(natural killer，NK)的增殖和免疫活性，在预防自身免疫性疾病以及移植排斥方面起到至关重要的作用，但同时也是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一。研究表明肿瘤患者Treg数量较正常人升高，即肿瘤通过某种机制诱导了Treg的分化，而Treg又可以抑制机体的免疫反应，从而有利于肿瘤的生长和转移。对SOCS1的研究不仅证实它是抗肿瘤免疫反应初始阶段和效应阶段的抗原呈递弱化因子，也为我们提供了一条可能克服Treg介导的肿瘤免疫耐受的抗原特异性的新途径。因此，对SOCS1等抗原呈递弱化因子的抑制是一种新的消除宿主水平自身耐受的有效方法，从而可诱导更有效的抗肿瘤免疫反应。

高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein box 1 protein，HMGB1)

仅仅抑制可诱导的反馈抑制因子SOCS1尚不足以激活DCs，因为促炎症反应的刺激，如TLRs激动剂或细胞因子，是启动前炎症信号级联放大所必须的。警报素(alarmins)是近年来提出的一类具有DCs募集和活化双重作用的内源因子。Alarmins可以通过促进抗原的摄取、处理和呈递来增强对抗原特异性免疫反应的诱导，从而在对获得性免疫进行预警的过程中起到关键作用。

HMGB1为alarmins家族中最为受关注的成员。最早研究发现HMGB1是一种非组蛋白核蛋白，在核内能够识别和结合DNA，参与DNA的转录、复制、修复以及细胞运动等。HMGB1分子由251个氨基酸组成，含有与DNA结合的结构域A盒(aa1～79)和B盒(aa 89～163)，以及1个高度重复并富含酸性氨基酸的C末端(aa 186～215)。其中，B盒前20个氨基酸是其发挥细胞因子活性的关键位点。A盒蛋白能取代全长HMGB1而与相应受体结合，但不发挥生物学效应。HMGB1通过坏死的细胞被动释放和激活巨噬细胞主动分泌两种途径被释放到细胞外，发挥TLRs样受体激动剂的作用。HMGB1的基因同源性很高，人和鼠的同源性在99％以上。

HMGB1可刺激树突状细胞(DCs)成熟，上调人单核细胞来源的DC表面CD83、CD54、CD80、CD40、CD58及MHC II类分子等的表达，并能够促使其分泌IL-12、IL-6、IL-1、IL-8、TNF-α及RANTES等促炎细胞因子；HMGB1能促使DC从CCL5敏感(未成熟表型)转变为对CCL21敏感(成熟表型)，从而有利于DC迁移至次级淋巴结；HMGB1本身也是未成熟DC的趋化因子；混合淋巴细胞反应中，B盒刺激的DC可诱导同种T细胞分泌IL2和IFN-γ，并分化为Th1细胞；给予抗HMGB1中和抗体、抗A盒或抗RAGE抗体，可使成熟DC表面CD80、CD83和CD86表达上调受阻，并对DC分泌IL12、克隆扩增和初始T细胞存活显示抑制作用。HMGB1也可直接作用于T、B细胞。成熟的DC通过分泌HMGB1而促进CD4+T细胞增殖、生存和分化为Th1细胞。HMGB1也参与自身反应性B细胞活化。鉴于其对DC强大的募集和活化作用，HMGB1可作为刺激抗原特异性免疫反应的强效佐剂。

肿瘤相关抗原-NY-ESO-1，MAGE3