[发明专利]一种检测天麻多糖中单糖组成的方法

说明书

技术领域

本发明涉及多糖组分分析领域。具体涉及一种检测天麻多糖中单糖组成的方法。

背景技术

天麻(Gastrodia elata Blume)属兰科非自养型植物的干燥块茎，是我国传统的名贵中药，天麻具有平肝熄风止痉之功效，主要用于治疗治疗头痛眩晕、惊风抽搐、肢体麻木、面肌痉挛、高血压、冠心病等疾病。早期的研究者提取分离出天麻中许多活性成分，包括天麻素、天麻苷元、派立新、香草醇、对羟基苯甲醛、甾醇、柠檬酸、琥珀酸等。近年来，许多研究工作者都从天麻中分离得到了天麻多糖，并对其药理活性进行了实验研究，结果表明，天麻多糖具有清除自由基、抗眩晕、降血压，增强免疫，抑菌等功效。

多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。随着分子生物学和细胞生物学的发展，多糖及其缀合物作为支持组织和能量来源的传统观念早已被突破，而被认为是生物体内除核酸以外的又一类重要的信息分子，而且由于它们常是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞间信息的传递和感受的关键因子，因此，具有生物活性的活性多糖的研究日益受到重视。

多糖的生物活性与其平均分子质量大小和单糖组成有密切的关系，所以检测多糖中单糖的组成对多糖生物活性的研究有很大的帮助。

用于多糖测定的方法主要有显色法、气相色谱法、毛细管电泳法、阴离子色谱法，C18柱HPLC-UV法等。其中显色法只能检测总多糖含量，专属性差。气相色谱法过程复杂而且会出现异构化色谱峰。毛细管电泳法存在灵敏度差的缺点。阴离子色谱法所用柱子价格昂贵，且需要很长的时间来平衡。C18柱HPLC-UV法对植物多糖中单糖组分的检测具有检测设备相对便宜，灵敏度高，准确性好等优点，被越来越多的多糖研究人员采用。

目前，天麻多糖的检测主要用到上述的显色法和阴离子色谱法，未见天麻多糖中单糖检测用到C18柱HPLC-UV法的研究报道。由于干扰成分和单糖组成的不同，在直接使用文献中报道的其他多糖C18柱HPLC-UV法检测时，总会出现各种各样的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种方便、稳定、准确的检测天麻多糖中单糖组成的方法。

本发明针对天麻多糖检测过程中干扰成分和组成单糖的不同，在现有C18柱HPLC-UV法检测其他植物多糖的基础上，进一步发展和改进，形成了一种新的方法用于天麻多糖中单糖组成的检测。

本发明的技术解决方案为：

从天麻中提取制得的天麻多糖，先通过酸水解使其成为单糖，然后加入衍生化化试剂进行衍生化，衍生化完成后，进入HPLC系统检测。在HPLC系统中，使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱进行分离，柱温35℃，流动相是按一定比例混合的缓冲盐和有机溶剂，流速0.8～1.5ml/min，紫外检测器，波长220～360nm。

在本发明中，天麻多糖首先加酸水解形成单糖，所用酸选自无机酸或有机酸，包括但不限于盐酸、硫酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸等。水解物用衍生化试剂进行衍生化，所用衍生化试剂包括但不限于1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)。

在HPLC系统中，使用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱子内径、颗粒粒径和柱子长度可任意选择，只要能分离开各个单糖即可。流动相为缓冲溶液和有机溶剂的混合液，所用缓冲溶液是弱酸与其盐的混合溶液，包括但不限于磷酸二氢钾水溶液-氢氧化钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、醋酸-醋酸钠水溶液、醋酸铵水溶液-醋酸、柠檬酸-柠檬酸钠水溶液等，所用有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈等。流速在0.8～1.5ml/min范围内任意选择。紫外检测器的波长在220～360nm间任意选择。

使用本发明所述方法，可一次性分离检测出天麻多糖中各个单糖含量，方法的专属性强，灵敏度高，准确性好。所使用的仪器设备比较常见，方法容易实现，检测成分较低。

附图说明：

图1天麻多糖HPLC检测色谱图

具体实施方式：

实施一

1.仪器与试药

1.1仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪(美国戴安公司)；水浴锅BC-W203(上海贝凯)；XS105电子天平(Mettler-Tolledo)

1.2试药

超纯水，娃哈哈纯净水；甲醇、乙腈均为色谱纯迪马公司；氯仿、甲醇、浓硫酸、葡萄糖、NaOH、盐酸、冰醋酸、乙酸铵均为分析纯广州试剂厂；甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖均为分析纯上海试剂二厂；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)分析纯天津大茂。

2.色谱条件