[发明专利]丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及丝胶蛋白的加工利用领域，特别涉及一种骨组织工程中丝 胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架材料的制备方法。

背景技术

骨损伤和骨缺损是日常生活中非常常见的疾病。传统医学主要采用自 体和异体移植的方法进行骨缺损的修复，但这种方法有出现新损伤以及发 生免疫排斥反映等弊端，并不是理性的骨修复方法。而骨组织工程是用少 量的组织细胞经体外培养扩增后修复骨缺损，同时可依据骨缺损情况任意 塑型达到完善的形态修复，为实现无损伤修复开辟了新的途径。

丝胶蛋白(Silk Sericin简称SS)是一种球状蛋白，相对分子量为1.4～ 31.4万，由18种氨基酸组成。丝胶蛋白具有良好的水溶性、吸水性、生物 相容性，能抑制酪氨酸酶的活性，具有抗氧化性、抗凝血、抗肿瘤等特性。 作为一种天然蛋白质资源，丝胶可应用于生物材料和医药领域等。

羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA，图1)是一种生物活性陶瓷，其化 学组成和结晶结构类似于人体骨骼中的磷灰石。HA分子中的Ca2+可以与 含有羧基的氨基酸、蛋白质、有机酸等发生交换反应，具有良好的骨传导 性能和生物活性，能与骨组织形成牢固的骨性结合促进骨骼生长，相态较 稳定，无毒性、发炎性，是公认的性能良好的骨修复替代材料。但也存在 脆性大、韧性较差、力学性能不足，降解缓慢且易从植入位点迁移等缺点， 这都限制了其作为人体材料种植体的使用。

发明内容

本发明的目的是分别合成羟基磷灰石粉末和制备丝胶蛋白溶液，将两 者按不同质量比例混合，通过冷冻干燥方法制备丝胶蛋白/羟基磷灰石复合 多孔支架材料。

本发明的一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法，包括以 下步骤：

(1)量取一定量丝胶溶液置于烧杯中，按比例向其中加入羟基磷灰 石粉末，保持丝胶蛋白与羟基磷灰石的总量在溶液中的比例相一致；

(2)将丝胶蛋白与羟基磷灰石的混合溶液放入超声波清洗器中，振 荡处理3～5min；

(3)取出混合溶液，向其中缓慢滴加微量的浓度为0.5％的戊二醛交 联剂，磁力搅拌器缓慢搅拌均匀；

(4)将混合溶液快速移入96孔细胞培养平板，并立即放入-20℃冰 箱中预冷冻12h；

(5)将冷冻12h后平板样品取出，在室温20℃条件下，进行回温处 理4h；

(6)将回温后的平板样品再次放入-20℃冰箱中冷冻，然后放入-80 ℃冷冻干燥机中冷冻干燥，制得不同比例的丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔 支架。

所述的丝胶溶液，它的制备方法，包括以下步骤：

(1)将去蛹后的桑蚕茧层，放入沸水中进行脱胶处理；

(2)30min后，停止蒸煮，过滤去杂；

(3)将过滤后的丝胶溶液放入旋转蒸发仪中浓缩，获得目的浓度的 丝胶溶液。

所述的羟基磷灰石粉，它的制备方法，包括以下步骤：

(1)取饱和Ca(OH)₂溶液，置于60℃水浴中，滴加10％wt的H₃PO₄溶液，和Ca(OH)₂溶液和H₃PO₄溶液的体积比为70∶1～2，期间不断快速 搅拌并保持水温；

(2)以滴加氨水的方法，调整溶液的pH保持在8.7；

(3)滴加完H₃PO₄溶液后继续搅拌3h，搅拌结束后置于室温静置48 h；

(4)倾去上层清液，收集下部沉淀；沉淀先用无水乙醇清洗2-3次， 再用蒸馏水清洗3-4次；

(5)将得到的沉淀放入冰箱中冷冻，然后移入冷冻干燥器中干燥， 研磨，得到羟基磷灰石粉末。

一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合多孔支架的制备方法，所述步骤(1) 中丝胶蛋白与羟基磷灰石的重量比为10∶1～1∶1。

丝胶溶液的制备方法，所述步骤(1)中水的用量是到将茧层浸没。

丝胶溶液的制备方法，还包括获得目的浓度的丝胶溶液后，抽取丝胶 溶液，进行SDS凝胶电泳，测定丝胶蛋白分子量。