[发明专利]黄花蒿叶表面腺毛的观察及密度测定方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生命科学技术领域，具体地涉及到一种黄花蒿叶表面腺毛光学显微镜观察与密度测定的方法。

背景技术：

黄花蒿(Artemisia annua L.)又名臭蒿，为菊科(Asteraceae)蒿属(Artemisia)植物。黄花蒿的叶表面存在两种毛状体，为非分泌型毛状体和腺毛，其中腺毛对青蒿素的生物合成十分重要，被认为是青蒿素生物合成与储存的场所。青蒿素是我国学者首次从黄花蒿中分离得到的一种倍半萜内酯过氧化物，是治疗疟疾的特效药，国际市场需求量非常大。进一步的药理研究证明，青蒿素及其衍生物具有杀死多种癌细胞的作用，包括乳腺癌细胞、血癌细胞、黑色素瘤细胞、肾癌细胞、中枢神经系统肿瘤细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞等，而对正常细胞损伤很小，并且与传统化疗药不存在交叉耐药。有望将青蒿素及其类似物开发成高效、低毒、价廉、谱广的抗癌新药，具有广泛的应用前景。

已有研究证明，腺毛的密度直接与青蒿素的产量呈正相关。对腺毛的研究将有利于揭示青蒿素生物合成的机理，为提高黄花蒿中青蒿素的含量提供新的途径。此外，由于腺毛的密度与青蒿素含量相关，因而腺毛密度也将成为黄花蒿遗传育种的一个非常直观的考察指标。

由于腺毛非常细小，肉眼无法看到，目前基本是借助电子显微镜或荧光解剖显微来观察黄花蒿叶表的腺毛。蔡刘体等人(“烟草叶片表面腺毛形态的扫描电镜观察”，Chinese Agricultural Science Bulletin Vol.24 No.8 2008年8月)公开了一种采用扫描电镜的方法对叶片表面的腺毛形态和细微结构进行观察的方法，其中涉及各种化学试剂来制备电镜扫描样品，如：2.5％戊二醛固定4h；1％锇酸4h；0.1M磷酸缓冲液洗涤6次，每次15min；然后依次用梯度浓度为30％、50％、70％、90％的酒精逐级脱水，每次15min；无水丙酮(提前2d加无水氯化钙)脱水3次，每次15min；醋酸异戊酯(提前2d加无水氯化钙)置换2次，每次15min。将干燥后的样品进行真空喷镀。由于电子显微镜和荧光解剖显微都非常昂贵，非一般实验室所具备，并且需要各种化学试剂，导致实验成本较高，仪器操作复杂繁琐，实验材料处理工序很多，造成实验结果往往不理想。

朱卫平等人(“黄花蒿腺毛状分泌腺的起源和发育”，《湖南农业大学学报(自然科学版)》第33卷第4期第416-418页，2007年8月)报道了利用光学显微镜观察黄花蒿腺毛的方法，但该方法一般需要复杂的切片和染色过程，而且无法观察到黄花蒿叶表面整体腺毛生长情况，比如说无法知道腺毛密度情况等。另外，涉及切片和染色的繁琐，该方法只能适用于单个或少数样品的检测，难以实现高通量样品的黄花蒿腺毛的观测。

中国公开专利CN101556215(申请号：200910022472，名称为“一种田间试验无损伤定位观察植物气孔的取样方法”)公开了一种简单的田间试验无损伤定位观察植物气孔的取样方法。该方法包括：在拟观察部位均匀薄薄的涂布一层指甲油；用透明胶带贴于指甲油膜上，中心部位对准；将透明胶和指甲油膜一起揭下，用解剖针辅助使指甲油膜与叶片分离；将揭取的胶带与指甲油膜复合膜平面贴实于干净载玻片上；用解剖针或洁净刀片缓慢引导以防止气泡，指甲油膜四周必须至少有1～2mm透明胶带并贴实于载玻片上，把指甲油膜封闭在载玻片上；显微镜观察与测量。然而，这种观测叶片表面的方法只能用于不易变形的气孔组织，如果应用于观察腺毛显微结构，不但会破坏了叶片腺毛结构，同时导致整体腺毛数量和密度发生失真，难以用于黄花蒿叶表面的腺毛观测中。

因此，建立简单、快速、低成本以及高通量的黄花蒿叶表面腺毛观察方法是非常必要的，也将为青蒿素生物合成研究提供一个新的有力工具，对黄花蒿的生产以及质量评价有重要的应用价值和指导意义。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对目前尚无观察黄花蒿叶表面腺毛的相关技术，提供一种黄花蒿叶表面腺毛的观察及密度测定方法，利用试剂A(石油醚或正己烷)、试剂B(无水乙醇或甲醇)、试剂C(冰醋酸)快速处理，然后用光学显微镜观测黄花蒿叶腺毛形态、分布及测定其密度。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种黄花蒿叶表面腺毛的密度测定方法，该方法包括如下步骤：